雷帕霉素诱导细胞自噬在衰老相关疾病中的作用

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雷帕霉素靶蛋白(target of rapamycin,TOR)是一种进化上十分保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,是磷酯酰肌醇3激酶/蛋白激酶B (PI3K/Akt)信号途径的关键蛋白。TOR首先在酵母中被发现,随后在哺乳动物中也发现了TOR的同源物,统称为哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)。mTOR信号通路可接受激素、能量、营养、氧化应激、生长因子等多种信号的刺激,参与基因转录、蛋白质翻译、核糖体合成等生物过程。该通路在细胞生长、增殖、凋亡和自噬等相关调控中起着重要作用,mTOR信号通路的异常激活导致肿瘤的发生,并与抗免疫反应、衰老及神经退行性疾病的发生发展密切相关[1]

mTOR存在mTORC1和mTORC2两种不同的复合物。mTORC1对雷帕霉素敏感,主要调节细胞生长、增殖、凋亡、能量代谢和自噬,mTORC2对雷帕霉素不敏感,主要参与细胞骨架重组和细胞存活有关。一系列的药物筛选结果表明,mTOR信号通路是抗肿瘤、抗免疫反应及抗衰老药物的靶点。雷帕霉素(rapamycin,RAPA)是第1个已知的mTOR通路抑制剂,分子式为C51H79NO13,作为一种传统的大环内酯类抗生素,雷帕霉素首先从真菌Streptomyces hygroscopicus中分离,在上世纪70年代用作抗真菌药物,1999年获得美国FDA认证,用于抵抗器官移植病人的急性免疫排斥反应[2]。近些年,RAPA及其类似物抗肿瘤活性和抗衰老的功能逐步被发现,对于糖尿病、心血管病等也有一定的作用,并逐步应用于相关的临床治疗。本文以衰老和衰老相关的神经退行性疾病为对象,综述RAPA诱导自噬影响生物寿命,在早老症、亨廷顿病、帕金森病及阿尔茨海默病等方面的应用和作用机制。1 雷帕霉素延长寿命

雷帕霉素调节寿命始于酵母的研究。2006年Powers等[3]筛选了4 800多个单基因缺失酵母菌株的时序性寿命,发现长寿菌株均存在TOR通路的突变。敲除酵母S6K或SCH9基因,酵母的时序性寿命翻倍[4];用TOR复合体的抑制剂雷帕霉素或硫酸甲硫氨酸(methionine sulfoximine)处理酵母细胞,或者let-363或daf-15基因突变,同样延长其时序性寿命,这些结果均说明雷帕霉素抑制TORC1信号通路,影响寿命。线虫中的研究同样表明,雷帕霉素能触发TORC1的抑制,使得SKN-1/Nrf和DAF-16/FoxO激活,线虫的寿命延长,应激抵抗能力也得到加强[5]。雷帕霉素喂养的果蝇寿命被延长,且果蝇对饥饿和百草枯的抗性提高,细胞的自噬和蛋白质翻译也均有所改变[6]。雷帕霉素喂养小鼠能延长小鼠寿命,已被3个独立的实验所证实[457]。mTORC1下游基因S6K1敲除延长♀小鼠寿命,但对♂小鼠不起作用。从4月龄小鼠开始逐步喂养雷帕霉素,能分别提高♀、♂小鼠寿命16%和11%,转录组学上主要的变化与13条信号通路相关,在♀♂小鼠内均有明显变化[8]。存活了600 d的老龄小鼠使用雷帕霉素治疗后,寿命也得到了延长[7]。雷帕霉素延长寿命已十分肯定,表明mTOR信号通路在衰老中起着十分重要的作用。2 雷帕霉素的自噬作用机制

酵母中TOR通路的抑制与能量限制(calorie restriction,CR)延长寿命存在相似机制,均能增强Sir2p (silent information regulator two protein)活性和rDNA稳定性,转录因子Msn2p和Msn4p从胞液重新定位到细胞核,并能提高PNC1(pyrimidine nucleotide carrier 1)基因的表达[9]。雷帕霉素影响寿命涉及的机制十分复杂,主要包括影响蛋白质的翻译、应激和外源物代谢的抵抗、线粒体功能、炎症反应、干细胞功能以及自噬等[10]

雷帕霉素促进自噬是一个关键的mTORC1调节过程,在延长寿命中可能处于核心地位。自噬是真核细胞溶酶体对受损细胞器和老化蛋白的一种主动清除方式,有证据表明,自噬降解能力随年龄增长而下降,导致损伤积累及年龄相关的细胞功能下降。细胞自噬过程中涉及的特异性基因统称为自噬相关基因(autophagy related gene,Atg),酵母中的Atg主要包括:Atg1、Atg13、Atg17、Atg29、Atg31等,其中Atg1起着关键作用。哺乳动物中Atg1的同系物是ULK(UNC-51 like kinase)家族蛋白ULK1和ULK2[11]。自噬的调控途径主要涉及经典的磷酯酰肌醇3激酶/蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白(PI3K/Akt/mTOR)信号途径。雷帕霉素通过抑制mTOR,诱导和促进细胞自噬过程,清除各种老化蛋白,从而延长生物体的寿命。

在酵母和线虫中,雷帕霉素延长寿命仅仅只有当自噬被诱导时才可实现。雷帕霉素不能延长缺失自噬相关基因ATG1或ATG7的酵母寿命[12],同样地,敲除秀丽隐杆线虫的自噬相关基因bec-1(蠕虫同源基因Atg6/beclin 1)或vps34,雷帕霉素也不能延长其寿命。果蝇中若S6K过表达,4E-BP1被抑制或RNAi沉默自噬基因Atg5后,雷帕霉素延长寿命被逆转[6]。这也证实了在酵母、线虫和果蝇中,雷帕霉素确实能通过诱导自噬延长寿命。

雷帕霉素诱导并促进自噬过程在早老症(hutchinson-gilford progeria syndrome,HGPS)、神经退行性疾病等衰老相关的疾病中起着十分重要的作用。3 雷帕霉素与早老症3.1 早老症

早老症是一种罕见的遗传性疾病,呈散发性常染色体显性遗传,人群发病率约是四百万分之一。HGPS患儿的衰老速度相当于正常儿童的5~10倍,刚出生时与正常人无异,但是到1~2岁时就会表现出明显的早老症状。这些明显的早老症状包括前额突出、身材矮小、下颌骨退化、头皮静脉清晰可见、秃头、皮下脂肪减少等[13]。事实上,HGPS患儿都要经历器官加速老化的过程。HGPS患儿的平均寿命大概是14岁,大多死于心肌梗死或中风。绝大多数HGPS病例因为LMNA基因第11个外显子发生突变,激活了1个隐蔽的剪切位点,产生了一个内部缺失50个氨基酸的A型核纤层蛋白前体,这个被截短了的A型核纤层蛋白前体通常称为早老蛋白(progerin),它缺失了A型核纤层蛋白前体关键的翻译后修饰步骤。正常的A型核纤层蛋白前体C端为“-CAAX”模体,“-CAAX”引发模体中的“C”(半胱氨酸)被蛋白法尼酰基转移酶法尼基化,接着包含“-AAX”在内的C端的18个氨基酸残基被金属蛋白酶Zmpste24和肽链内切酶RCE1两个内切酶切除,释放出来成熟的A型核纤层蛋白[14]。法尼基化的功能是将A型核纤层蛋白前体插入核膜以进行后续的金属蛋白酶Zmpste24和肽链内切酶RCE1剪切过程。Progerin保留了C端的“-CAAX”模体,能够被法尼基化,但是它缺失了Zmpste24酶切位点,导致其C端区域不能被释放,永久法尼基化的progerin无法从核膜上脱离下来,最终使细胞核结构和功能受损。光镜和电镜下可见HGPS患者的细胞核形态发生明显的改变:核膜“出泡”,核纤层蛋白层增厚,核周异染色质缺失,核孔聚集。这些病变随细胞老化而恶化,而且严重程度与progerin浓度正相关,通过细胞转染或注入progerin能产生相同的改变。3.2 雷帕霉素自噬清除progerin

近来有研究表明,雷帕霉素可以拯救HGPS成纤维细胞的表型并且能够抑制mTOR,诱导自噬清除progerin[15]。雷帕霉素减少HGPS成纤维细胞progerin的水平,是通过诱导自噬作用来清除progerin。联合使用雷帕霉素和溶酶体质子泵抑制剂洛霉素A1处理HGPS成纤维细胞后,自噬清除作用明显受到了抑制,progerin的清除明显减少;在雷帕霉素治疗的HGPS成纤维细胞中,用小干扰RNA(siRNA)干扰特定的自噬相关基因ATG7的表达,progerin的累积明显增加[16]

为了进一步验证HGPS成纤维细胞中progerin自噬清除的机制,Cao等[17]检测了progerin的泛素化状态。蛋白质泛素化近来作为选择性自噬清除的一个非常重要的信号出现,选择性自噬清除包括自噬受体蛋白,需要结合泛素化桥和自噬体(如p62)。不同类型的泛素化链具有不同的效应,例如,多聚泛素化链K48被识别后,通过蛋白酶体促进蛋白质的降解,而多聚泛素化链K63则通过自噬作用清除低聚体和聚集的蛋白质[18]。Cao等[17]发现progerin偏爱被K63相关的多聚泛素化链泛素化,暗示着progerin可以成为自噬的一个基质;此外,progerin可以和自噬体p62发生免疫共沉淀反应,进一步证实了progerin是由自噬介导清除出去;最后,在雷帕霉素治疗的条件下,通过免疫荧光显微镜观察发现progerin总是和自噬体p62以及自噬相关FYVE蛋白(ALFY)聚集在一起。有趣的是,使用雷帕霉素治疗后,细胞核中的progerin明显地减少;相反核质中却聚集了p62和ALFY,这也暗示了p62和ALFY是清除progerin的工具。因为p62和ALFY能够与哺乳动物同源的Atg8(LC3)相互作用,这也说明了在泛素化桥和自噬体之间存在着一个功能联系[19]。由于ALFY正常情况存在于细胞核中,对于进一步揭示ALFY在清除细胞核中progerin方面的机制,有待研究者们深入探索。4 雷帕霉素与神经退行性疾病

与HGPS相似,细胞内蛋白质蓄积的现象在神经退行性疾病中同样存在,如亨廷顿病、帕金森病及阿尔茨海默病。雷帕霉素通过诱导和促进自噬过程,减少神经退行性疾病中的异常蛋白质的蓄积,有望成为新的防治神经退行性疾病药物。4.1 亨廷顿病

亨廷顿病(huntington disease,HD)是以突变的亨廷顿蛋白(mtHTT)为特征的常染色体显性遗传性疾病。如果mtHTT在神经元内聚集,形成毒性寡聚蛋白聚合物,将会导致细胞凋亡[20]。一些体内和体外对HD模型的研究证实,雷帕霉素能够诱导自噬作用,促进mtHTT的清除,从而防止mtHTT诱导的神经退行性变。细胞过表达mtHTT后,导致了毒性聚合物的形成,造成了细胞凋亡。在这些细胞中,雷帕霉素诱导自噬过程,增强了mtHTT的清除,减少了聚合物的形成,阻止了细胞凋亡。果蝇的光感受器神经元产生mtHTT后,用雷帕霉素治疗可阻止感杆(果蝇的感光细胞)的退化[21]。在HD模型小鼠中,用CCI-779(雷帕霉素类似物)治疗后,能抑制mTOR的活性,促进自噬,减少mtHTT的聚集[22]4.2 帕金森病

帕金森病(Parkinson’ disease,PD)是中老年人常见的一种神经退行性疾病,其主要的病理特征是黑质多巴胺能神经元的大量缺失和路易小体(Lewy小体)的形成。Lewy小体的主要成分是α-synuclein,它在PD患者中形成大量的聚集。雷帕霉素可以减轻由1-甲基-4苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)诱导的PD模型中多巴胺黑质纹状体的退化。雷帕霉素也可以通过抑制mTOR,诱导自噬清除α-synuclein聚集体,减少α-synuclein聚集体在α-synuclein转基因小鼠中的表达[23]。在细胞培养的过程中发现,当自噬受抑制时,A53T突变型α-synuclein比野生型α-synuclein浓度高,说明突变型α-synuclein比野生型α-synuclein更易聚集,更需要自噬的清除,雷帕霉素能够通过诱导和促进自噬过程,清除野生型和突变型的α-synuclein聚集体[24]4.3 阿尔茨海默病

阿尔茨海默病(Alzheimer’ disease,AD)是以记忆力缺失和认知功能障碍为特点的一种常见的神经退行性疾病。其典型的病理特征为:神经元外β-淀粉样蛋白(β-amyloid protein,Aβ)聚集形成老年斑(senile plaques,SP)、神经元内高度磷酸化的tau蛋白形成神经纤维缠结(neurofibrillary tangles,NFTs)及神经元的丢失[25]。在AD动物模型中,Aβ聚集导致了mTOR高表达,降低了自噬,且造成了tau蛋白过度磷酸化,最终导致Aβ和tau蛋白的聚集[26]。雷帕霉素通过抑制mTOR,诱导和促进自噬过程,减少了Aβ和tau蛋白的聚集[27]。雷帕霉素还能够改善AD模型小鼠的认知功能。

神经退行性疾病的普遍特征是神经细胞内异常蛋白质的聚集,雷帕霉素通过抑制mTOR增加自噬程度,从而促进神经退行性疾病中异常蛋白质的清除。此外,雷帕霉素还有抗老化和保护神经的作用,鉴于其多方面的杰出表现,雷帕霉素现已经被列为治疗神经退行性疾病的一种选用药,给衰老相关的老年性疾病患者带来了新的治疗希望。5 雷帕霉素的副作用

雷帕霉素治疗HGPS和神经退行性疾病患者是通过抑制mTOR,诱导自噬清除progerin实现,在抗炎、抗老化和保护神经等很多方面都具有非常可观的疗效。mTOR直接或间接地参与了细胞增殖、生长和代谢有关环节的调控。雷帕霉素抑制mTOR,不可避免会对患者的生长和发育造成一定的影响,在治疗的过程中也会带来不同程度的副作用。雷帕霉素传统地作为一种免疫抑制剂,抑制器官移植病人的免疫排斥反应,它最大的副作用就是抑制免疫系统。雷帕霉素治疗肾移植病人后,34%的患者遭受了病毒感染,16%的患者遭受了真菌感染[28],儿科的肾移植患儿使用雷帕霉素治疗后,生长发育至少延缓了2年[29]。在雷帕霉素治疗过程中,患者的新陈代谢也发生了改变,包括高血脂、胰岛素敏感性降低、葡萄糖耐受性差,增加了糖尿病的发生率[30]。雷帕霉素还给器官移植病人带来贫血、肾毒性、延缓伤口愈合及关节炎等副作用。尽管雷帕霉素在治疗器官移植病人过程中有那么多的副作用,对健康人是否产生实质的免疫抑制、免疫失调尚不清楚,另外使用的剂量和持续时间也是未知数,因此寻求作用更安全、更有疗效、副作用更小的雷帕霉素类似物对器官移植病人显得非常重要。有研究表明,雷帕霉素对HGPS患者的治疗效益远远大于它所带来的副作用,而且通过调整雷帕霉素的用药剂量和用药时间,可以减轻一定的副作用。6 总结

雷帕霉素诱导和促进自噬清除HGPS成纤维细胞中的progerin,减少神经退行性疾病中异常蛋白质的聚集,给HGPS患者及神经退行性疾病患者带来了新的治疗希望。雷帕霉素在临床上具有多种用途,对衰老及相关疾病的检测尚属起步阶段,一些检测和验证多数在细胞、无脊椎动物和小鼠模型中进行,未来可能有更多直接用于人类的研究,特别是用于人类延长寿命的尝试可能会逐渐增加。神经退行性疾病是老年人的常见病,直接影响人类的认知功能,与人类的健康寿命直接相关,雷帕霉素抑制mTOR对人类的认知功能有一定的效果,能提高成百万中老年人的生活质量,也能降低一些癌症、心血管病的风险。可见,雷帕霉素有很大机会用于预防性的医疗保健。

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