葡萄糖通过调节AMPK介导的TET2磷酸化揭示了糖尿病与肿瘤的内在联系

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糖尿病是一种复杂的代谢综合征,长期的高血糖水平可导致一系列严重并发症。流行病学研究表明,糖尿病也与肿瘤风险增加相关。高糖水平可能是导致糖尿病和肿瘤之间联系的主要因素,但人们对这种联系的分子基础以及高糖状态如何驱动导致肿瘤表型的遗传和/或表观遗传改变知之甚少,2018年《Nature》杂志发表了题为《Glucose-regulated phosphorylation of TET2 by AMPK reveals a pathway linking diabetes to cancer》的研究,揭示了这一现象背后的分子机制,现介绍如下。

高糖下调DNA 5-羟甲基化(5hmC)水平,且这一过程需要TET2介导

DNA甲基化(5mC)和羟甲基化(5hmC)是肿瘤中常见的表观遗传修饰。5mC转化为5hmC是通过氧化反应进行的,氧化反应是由双加氧酶TET蛋白家族催化的。本研究通过检测健康志愿者(血红蛋白A1c和糖尿病患者血中5hmC水平,发现与健康群体相比,糖尿病患者血中5hmC水平显著下降,而5mC水平保持不变(图1a, b, c)。糖尿病患者组中HbA1c水平与5hmC显示出显着的负相关。通过进一步观察正常血糖和高糖条件下培养的几种细胞系:PBMC,HUVEC和TF-1细胞系,提示在高糖状态下5hmC的水平较低,而A375、A2058和SK-MEL-5细胞系在两种葡萄糖条件之间没有显示5hmC水平的明显变化,同时这些细胞的5hmC基线水平较低。由于5-hmc的缺失是肿瘤的表观遗传学特征之一,并且TET2表达水平的降低具有重要作用,因此推测5hmC对葡萄糖反应的改变是通过TET2介导的。

为了揭示TET2在这种调节中的特殊作用,研究者使用A2058-TET2WT稳定细胞系(即过表达野生型TET2基因的A2058细胞系),其中TET1和TET3的表达低,TET2和5hmC水平的表达已经恢复。在A2058-TET2WT细胞系中发现高糖降低TET2WT细胞中TET2蛋白的水平,而TET2 mRNA水平保持不变,并且TET2的蛋白质半衰期显著缩短。此外,与天然A2058细胞不同,A2058-TET2WT细胞在正常葡萄糖培养7天后显示出5hmC水平的显著增加。然而,通过将培养基转换为高葡萄糖,又可以逆转这种增加(图1d)。而在表达模拟对照催化失活的全长TET2(TET2M)或催化活性C末端TET2(TET2CD)的稳定A2058细胞系中未观察到这种调节(图1e)。这些数据表明,随着细胞外葡萄糖水平的变化,5hmC的可逆性变化是由功能完整的TET2介导的。 

为了识别对葡萄糖反应的特异性5hmC变化,研究者深度测序分析了A2058-TET2WT细胞中5hmC的全基因组改变。结果表明,正常葡萄糖下5hmC高于高葡萄糖,而5mC没有显着差异(图1f),鉴定了30,217个差异的5-羟甲基化区域(DhMR),超过80%的区域在正常葡萄糖下5hm水平增加。该DhMR富集的大部分(65.4%)与基因区域相关,其中9.56%定位于启动子,55.84%定位于基因体(图1g)。通过比较在正常或高葡萄糖中培养的A2058-TET2M和A2058-TET2WT细胞的转录本(图1h),鉴定了当TET2存在时(A2058-TET2WT)在正常葡萄糖与高葡萄糖中差异表达的585个基因,但在A2058-TET2M细胞中则没有(图1h)。在这些基因中,发现在高葡萄糖条件下分别下调和上调的几种肿瘤抑制基因和肿瘤促进基因(图1i)。此外,发现585个基因中的213个(36.4%)在正常葡萄糖中含有增加的DhMR。这些基因由上调基因和下调基因组成,表明5hmC在基因调控中具有复杂的作用。

图1. Hyperglycaemia deregulates global DNA 5hmC levels, and this regulation requires a functional, full-length TET2

TET2是AMPK的底物,AMPK特异性磷酸化TET2的99位丝氨酸

AMPK是一种重要的营养或能量传感器,对葡萄糖水平非常敏感。TET2含有两个以99位点(S99)和1205位点(S1205)丝氨酸为中心的推定的AMPK基序(图2a)。此外,活化形式的AMPK(pAMPK172)可以与TET2免疫共沉淀(图2b)。通过使用高效液色谱相串联质谱分析,发现AMPK活化后,检测到了TET2的强烈磷酸化,特别是在S99位点(图2d),而其他推测的磷酸化位点几乎没有变化。进而通过放射性标记激酶等方法,揭示了TET2是AMPK的底物,并且S99是AMPK催化的主要磷酸化位点。

图2. TET2 is a substrate of AMPK, which specifically phosphorylates TET2 at S99.

 葡萄糖通过AMPK介导的TET2 99位丝氨酸磷酸化调节TET2稳定性

由于AMPK在血糖水平下降的能量应激时被激活,因此推测葡萄糖介导的TET2稳定性是通过AMPK磷酸化TET2S99来调节的。首先比较了在正常葡萄糖和高糖中培养的A2058-TET2WT细胞中TET2S99磷酸化水平,结果表明TET2S99的磷酸化状态在正常血糖情况下显著高于高糖状态(图3a, b),并且在从高葡萄糖转换为正常葡萄糖后第0、2和4天,pAMPK、TET2pS99和TET2均有稳定增加。这些增加在其他细胞系以及PBMC中都得到证实。值得注意的是,健康志愿者血中的pAMPK、TET2pS99和总TET2显著高于糖尿病患者(图3c)。这些数据表明TET2 S99被AMPK磷酸化,而AMPK本身活性在高糖条件下被抑制。

进一步研究发现,AMPK在正常葡萄糖中持续培养的细胞中保留了磷酸化活性,而在高糖的细胞中则失活。同时,在转化为高葡萄糖的细胞中,TET2蛋白的半衰期显著降低(图3d)。在使用AMPK激动剂处理细胞后,升高了pAMPK、TET2pS99、总TET2和5hmC的水平(图3e)。当用二甲双胍处理高糖培养的细胞时,TET2的半衰期明显增加(图3f)。这些数据表明AMPK和TET2S99磷酸化对于保护TET2稳定性是重要的。

为了进一步确定S99磷酸化的作用,研究者使用了表达磷酸化模拟突变体TET2S99D的A2058稳定细胞系。当用放线菌酮(CHX)处理时,TET2S99A突变体表现出比TET2S99D更低的稳定性。与更高的蛋白质稳定性一致,TET2S99D细胞在高葡萄糖中具有比TET2S99A细胞更高的5hmC;敲除AMPK后,观察到野生型细胞的5hmC水平明显下降,而TET2S99A和S99D细胞则没有这种影响(图3i)。综上所述,这些结果表明TET2pS99是一个由AMPK调控的“磷酸化开关”,对于调节TET2的稳定性和5hmC的水平至关重要。

图3. Glucose regulates TET2 stability via the TET2pS99 phosphorylation switch, which is controlled by AMPK

高糖促进肿瘤生长,这一促瘤作用可以被TET2和二甲双胍所逆转

为了研究AMPK-TET2轴如何将持续的高葡萄糖环境暴露转化为致癌的表型,研究者进一步观察了TET2和葡萄糖水平对细胞增殖的影响。A2058-TET2WT细胞在高葡萄糖中显示出比在正常葡萄糖中更高的细胞增殖率。这种TET2依赖性和葡萄糖影响的生长表型在独立模型TF-1细胞中得到验证。这些数据表明TET2在葡萄糖调节的肿瘤细胞生长中具有重要作用。

越来越多的研究表明,常用的治疗糖尿病药物二甲双胍也是一种潜在的抗肿瘤药物。本研究中,使用二甲双胍处理A2058-TET2WT、A2058-TET2S99A和对照细胞,发现TET2WT细胞中5hmC水平显著升高,而TET2S99A和对照细胞中没有。同时,二甲双胍显著减少了TET2WT细胞的增殖,但对TET2S99A或对照细胞没有影响。相反,TET2S99A突变体和对照细胞对二甲双胍处理没有显示出明显的生长抑制。这些结果在体外证明了二甲双胍是通过AMPK-TET2-5hmC轴来发挥其抗肿瘤作用。

动物实验中,使用TET2WT或对照A2058肿瘤异种移植BALB / c裸鼠,在糖尿病(图4 a, c)和非糖尿病条件下,TET2WT小鼠肿瘤明显小于对照A2058小鼠(图4 b, d)。值得注意的是,TET2WT糖尿病组小鼠的肿瘤明显大于非糖尿病小鼠。相比之下,在A2058对照组小鼠肿瘤不论在糖尿病还是非糖尿病条件下肿瘤大小几乎没有差异。这些结果与持续的糖尿病或高血糖环境损伤TET2-5hmC介导的肿瘤抑制作用相一致。

图4. Hyperglycaemia promotes xenografted tumour growth, which is suppressed by TET2 and further prevented by metformin.

本研究表明,升高的葡萄糖水平抑制AMPK介导的TET2 99位丝氨酸磷酸化,导致TET2的半衰期缩短,TET2稳定性下降,随后5-羟甲基胞嘧啶水平失调和TET2在体外和体内的肿瘤抑制功能失调,从而将糖尿病与肿瘤联系起来。在此项研究之前,也有一系列研究发现二甲双胍不仅可以降低血糖,也具有抗衰老和抗肿瘤的作用,可能给某些肿瘤患者带来益处。一些研究表明,二甲双胍可以通过激活AMPK,抑制mTORC1信号转导,促进肿瘤细胞凋亡。此外,在肿瘤微环境中,二甲双胍可以维持细胞毒性T细胞(CTL)的活性,发挥抗肿瘤作用。二甲双胍还能够促进肿瘤细胞表达的PD-L1降解,从而使得免疫系统可以监测并杀伤肿瘤细胞,表明二甲双胍或许可以作为辅助用药增强PD-1/PD-L1之外免疫治疗的效果。综上所述,本研究提出了一种新的模式,说明机体的糖尿病微环境如何直接重编程表观基因组,进而为肿瘤的预防和治疗提供了一种潜在的策略。

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