DNA损伤反应与DNA的修复

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DNA损伤的后果很严重,所以生物进化出了各种修复手段,针对不同类型的损伤。真核生物的DNA修复主要有4种类型:核苷酸切除修复(NER)、碱基切除修复(BER)、错配修复(MMR)和双链断裂修复(DSBR)。

真核生物的四种DNA修复类型。Prog Neurobiol. 2011 Jul; 94(2): 166–200.

NER可切除大片段的DNA损伤,BER可修复个别碱基的损伤,MMR用于修复碱基的错配,而DSBR又包括两种机制:非同源末端连接(NHEJ)和同源重组(HR)。NHEJ直接连接断端而不需要模板,HR使用完整的姐妹染色单体作为修复模板。

多数DNA修复用的蛋白在平时不会大量表达。例如很多修复途径需要核酸内切酶,但内切酶同时也可以降解核酸,造成额外的损伤,所以只有在需要时才会大量合成。其它与修复相关蛋白的表达以及活性也同样需要一个调控机制。

另一方面,修复会涉及DNA合成、染色质重塑等过程,需要足够的核苷酸、还原力、甲基和乙酰基供体等,所以这个调控机制还要负责启动代谢重编程,以提供代谢方面的支持。

DNA损伤修复需要代谢支持。Front Oncol. 2018; 8: 15.

这种调控机制由DNA的损伤触发,引起细胞内的一系列相关反应,统称为DNA损伤反应(DNA damage response,DDR)。DDR识别损伤,然后启动级联反应,根据损伤程度决定细胞命运。如果损伤严重到难以修复,细胞会进入凋亡甚至坏死;如果损伤轻微并可修复,细胞继续存活并启动修复程序。

DNA损伤反应调控细胞命运。Cancer Biol Ther. 2015 Jul; 16(7): 1005–1013.

DDR从两个方面对需要修复的细胞进行调整:一方面通过激活DNA损伤检查点阻止细胞进入有丝分裂期,直至修复完成;另一方面则激活并协调各种修复途径,以及诱导代谢重编程。

一般认为,DDR中起主导作用的是三个PI3K相关激酶(PIKK)家族的激酶:DNA依赖性蛋白激酶(DNA-PK)、毛细血管扩张性共济失调症突变激酶(ATM),以及ATM和Rad3相关激酶(ATR)。

三种DDR激酶的结构。Mol Cell. 2017 Jun 15;66(6):801-817.

DNA-PK和ATM主要参与DSB(双链断裂)修复,而ATR参与多种DNA损伤的修复,特别是与DNA复制相关的损伤。ATR的多功能性使其对于复制细胞的生存能力至关重要。

DNA-PK发现于1985年,1993年有人意识到它可能在体内被DNA双链断裂(DSB)激活。后来在肿瘤细胞和修复缺陷小鼠中的一系列实验证明DNA-PK对于DSB修复中的非同源末端连接(NHEJ)途径非常重要。

DNA-PK本身并不能识别损伤部位,它需要一种辅助的蛋白因子Ku80。其实DDR的三个激酶都是被特定的蛋白因子募集至DNA损伤位点的,ATM需要NBS1,ATR需要ATRIP。

DDR的募集和激活。Mol Cell. 2017 Jun 15;66(6):801-817.

Ku异二聚体的结构为篮状,具有容纳dsDNA末端的中心腔。Ku与断裂的双链DNA末端结合,然后募集DNA-PK并激活。DNA-PK结合并稳定DNA末端,随后募集其他NHEJ核心因子,将末端紧密对齐并连接起来。

DNA-PK参与NHEJ修复过程。Mol Cell. 2017 Jun 15;66(6):801-817.

NHEJ将两个断裂的DNA末端连接起来,无需修复模板。尽管NHEJ可能引入错误,但哺乳动物细胞中的大多数DSB是由此途径修复的。只有当NHEJ失效时,细胞才必须使用其他末端连接途径,例如由DNA聚合酶θ介导的末端引入途径,该途径可以引入广泛的突变。

在淋巴细胞发育过程中,需要通过基因重排产生抗体多样性,所以抗体和T细胞受体基因座中会产生DSB。这些DSB需要NHEJ进行修复,因此大多数NHEJ相关缺陷会导致哺乳动物严重的免疫缺陷。

DNA损伤反应与DNA的修复(二)

作为DDR的3个PIKK之一,DNA-PK在DDR中主要参与NHEJ过程。而另外两个PIKK,ATM和ATR具有更多功能。

ATM和ATR是DDR途径的主要换能器。Cold Spring Harb Perspect Biol. 2013 Sep; 5(9): a012716.

ATM是毛细血管扩张性共济失调症(AT)的突变蛋白,1995年被鉴定出来,并发现其C末端含有PI3K样激酶结构域。AT是一种常染色体隐性遗传病,患者同时还有免疫缺陷,易患恶性肿瘤。后来发现AT患者的细胞对放射线敏感,表明其突变基因与DNA修复相关。

在DDR中,ATM负责协调细胞对DSB(双链断裂)的应答,包括DNA修复、检查点激活、凋亡、衰老以及染色质结构改变、转录和mRNA剪接等。它是一种顶端激酶,可以响应DNA损伤而使数百种底物磷酸化。MRN复合体、Tip 60、ATR、PP2A和Wip1都可以调节ATM的激活。激活的ATM可以催化CHK2,SMC-1,FANCD2,BRCA1以及H2AX的激活。

DNA受损后,乙酰基转移酶TIP60 / KAT5可以识别带有H3K9me3组蛋白标记的裸露核小体,从而被募集到受损的染色质,并被屏蔽去磷酸化而维持激活状态。激活的TIP60可以通过乙酰化(FATC基序中的K3016)来激活ATM。

ATM对DSBR的调控。Mol Cell. 2017 Jun 15;66(6):801-817.

MRE11-RAD50-NBS1(MRN)复合物可以识别并结合DSB,然后募集并激活ATM。激活的ATM可以磷酸化CtIP(C-terminal-binding protein interacting protein),再与BRCA1(乳腺癌相关蛋白1)相互作用,形成BRCA1 / MRN / CtIP复合体,促进DNA末端切除,以形成单链DNA,从而促进HR(同源重组)修复。

另一方面,ATM也可以促进NHEJ(非同源末端连接)。ATM激活后可以将MDC1(mediator of DNA damage checkpoint protein 1)磷酸化,再募集E3泛素连接酶RNF168,后者将组蛋白H2A泛素化,从而与53BP1(p53结合蛋白1)结合。53BP1可以促进NHEJ并抑制HR。

DNA双链断裂是一种严重损伤,可引起缺失或染色体易位等突变。NHEJ和HR是DSB修复的两种主要方式,细胞需要选择针对特定情况的最佳修复途径。NHEJ在G1/S/G2期都可以起作用,而HR仅在DNA复制后的S期和G2期才有活性。

在S和G2期的DSB修复中,NHEJ约占70%,HR约占30%。细胞对二者的选择机制还有很多争议。现在一般认为53BP1和BRCA1是关键分子,在选择中起着拮抗作用。

用于选择DSB修复途径的53BP1-BRCA1网络。J Biol Chem. 2018 Jul 6;293(27):10502-10511.

HR需要对DSB进行末端切除,以产生3’端ssDNA,然后才能募集重组酶RAD51,以姐妹染色单体作为模板进行修复。所以DNA的末端切除是选择哪条途径的关键。Ku和53BP1对末端具有保护作用,所以会促进NHEJ;而BRCA1可以促进53BP1去磷酸化来减轻53BP1的切除障碍,并重新定位53BP1,从而促进HR。

5′-末端切除可以暴露出一些同源序列,使3′-单链DNA稳定退火,从而促进某些不同的修复方式。替代的末端连接(a-EJ)途径利用ADP-核糖聚合酶和DNA Polθ等因子,需要2至20 bp的微观同源性。单链退火(SSA)修复途径需要 25 bp以上的同源性。

NHEJ与其它双链断裂修复。J Biol Chem. 2018 Jul 6; 293(27): 10512–10523.

ATM的另一个关键底物是CHK2(检查点激酶2),激活其可以通过多种蛋白质,包括p53和CDC25A的磷酸化,促进细胞周期停滞和细胞凋亡。CHK2的T68磷酸化经常被当作ATM激活的指标,虽然ATM并非其唯一激活途径。

ATM通过CHK2调节细胞状态。Eur J Pharmacol. 2009 Dec 25; 625(1-3): 143–150.

有研究表明,除DSB外,氧化应激也可以激活ATM。此时ATM在Ser-1981磷酸化,从而导致p53和AMP活化的蛋白激酶-α(AMPKα)的磷酸化,调节细胞基因表达和能量代谢。

DNA损伤反应与DNA的修复(三)

在3个DDR激酶中,DNA-PK和ATM主要被DNA的双链断裂(DSB)激活,而ATR主要被各种单链损伤激活,参与多种DNA损伤的修复,对于复制细胞的生存能力至关重要。

ATR的全称是ATM和Rad3相关激酶(ATM and Rad3 related)。Rad3是一种酵母蛋白,与ATM蛋白相似。rad3突变体对电离辐射敏感,并显示检查点缺陷。ATR是其在人体中的对应基因,1996年被克隆。

ATR通过其伴侣蛋白ATRIP被募集到覆盖有复制蛋白A(RPA)的损伤区域。RPA是真核生物的单链DNA结合蛋白,损伤处的单链DNA(ssDNA)被RPA包围后会募集ATR-ATRIP复合物。

RPA-ssDNA是许多DNA修复途径的重要结构。除了HR外,RPA-ssDNA还参与核苷酸切除修复,错配修复,碱基切除修复和复制叉重启。ATR-ATRIP识别RPA-ssDNA的能力使其在感知DNA损伤和复制压力方面非常重要。

ATR的多步骤激活。Cold Spring Harb Perspect Biol. 2013 Sep; 5(9): a012716.

ATR的激活是一个复杂的多步骤过程,包括ATR的自磷酸化,Rad17-Rfc2-5募集到ssDNA和dsDNA之间的连接处,装载Rad9-Rad1-Hus1(9-1-1)检查点钳以及募集TopBP1等。

TopBP1(DNA topoisomerase 2 binding protein 1)具有刺激ATR激酶活性的ATR激活域,激活域的失活突变对哺乳动物细胞是致命的。另一种ATR激活蛋白ETAA1含有与TopBP1类似的ATR激活域,但它可通过直接与RPA结合而被募集,可能负责不同类型的损伤。

ATR的激活导致多种下游靶标,如CHK1、SMC-1、ATM和p21等的磷酸化。其中CHK1是最为重要的一个分子,它可以调控Cdc25A、RAD51、p53和DNA-PK等分子,调控多种细胞过程。

ATR募集与CHK1激活。Mol Cell. 2017 Jun 15;66(6):801-817.

CHK1促进CDC25A的蛋白酶体降解,可以降低CDK(细胞周期蛋白依赖性激酶)活性,抑制细胞周期进程,为DNA修复争取时间。CHK1还通过BRCA1、BRCA2和RAD51的磷酸化促进HR(同源重组),通过DNA-PK的磷酸化促进NHEJ等。

CHK1和CHK2都可以通过p53调控细胞周期和凋亡,这是ATM和ATR途径的交叉点之一。其实二者有很多crosstalk,构成了复杂的调控网络。

DDR信号网络。Pharmacol Ther. 2014 Sep; 143(3): 323–336.

ATM和ATR都可诱导细胞的代谢重编程。有研究表明,ATM可通过诱导限速酶6-磷酸葡萄糖磷酸脱氢酶(G6PD)来激活PPP,以提供足够的NADPH和5-磷酸核糖。ATR可促进核糖核苷酸还原酶亚基RRM2在转录和翻译后水平上的上调,从而增加脱氧核糖核苷酸的供应。

DNA损伤修复中涉及的主要代谢途径。Front Oncol. 2018; 8: 15.

对于多数调控过程来说,为了能够及时启动与停止,磷酸化反应必须是可逆的,所以需要一系列相应的激酶和磷酸酶。DDR也是这样,激酶与磷酸酶的协同作用共同维持细胞对DNA损伤的合理应对。

参与DNA损伤反应的磷酸酶。Int J Mol Sci. 2020 Jan 10;21(2). pii: E446.

NER(核苷酸切除修复)用于修复大片段的DNA损伤。BER(碱基切除修复)可修复个别碱基的损伤。这两种修复以前统称为切除修复,都是由特异的核酸内切酶识别DNA的损伤部位,在其附近将DNA单链切开,再由外切酶将损伤链切除,由聚合酶以完整链为模板进行修复合成,最后由连接酶封口。

二者识别损伤的蛋白不同。BER针对DNA中因氧化,甲基化等化学修饰而损坏的单个碱基,所以第一步需要糖苷酶识别并切断损伤碱基形成的N-糖苷键,如8-氧代鸟嘌呤-DNA糖基化酶(OGG1),3-甲基腺嘌呤-DNA糖基化酶(MPG)或核酸内切酶VIII-like 1(NEIL1)等。

BER过程。Nucleic Acids Res. 2013 Oct; 41(18): 8403–8420.

在NER中,DNA损伤结合蛋白2(DDB2,p48)与DDB1形成复合物,可以识别UV诱导的环丁烷嘧啶二聚体(CPD)。XPC和hRad23B形成的二聚体可识别紫外线诱导的6-4PP(另一种嘧啶二聚体)。RPA-XPA复合体识别6-4PP和顺铂损伤等。

BER的第二步是用AP(apurinic/apyrimidinic,缺嘌呤或缺嘧啶)核酸内切酶来切开已经切除了错误碱基的DNA链,然后用DNA聚合酶β填补缺口等。有时会发生链取代反应,称为long-patch BER,而前者称为short-patch BER。长补丁途径还涉及侧翼核酸内切酶(flap endonuclease 1,FEN1)和PCNA(复制体上的滑动钳)等因子。

NER过程。Nucleic Acids Res. 2013 Oct; 41(18): 8403–8420.

NER的切除过程更加复杂,需要在损伤部位两侧切口,涉及转录因子TFIIH和一系列着色性干皮病(XP)蛋白。XP是一种常染色体隐性遗传病,导致皮肤干燥,有色素沉着,易患皮肤癌。

与该疾病相关的遗传缺陷至少有八种,导致不同形式的XP,即XPA(XPA基因),XPB(ERCC3基因),XPC(XPC基因),XPD(ERCC2基因),XPE(DDB2)基因),XPF(ERCC4基因),XPG(ERCC5基因)和XPV(POLH基因)。XPA-XPG参与核苷酸切除修复(NER),而XPV编码参与前导链中受损DNA复制的DNA聚合酶。

NER和BER过程中的很多蛋白可以被DDR诱导,如p53、BRCA1可以上调DDB2、XPC、PCNA、FEN1等的表达。

还有一类称为直接逆转(DR)的修复,可以逆转某些形式的碱基损伤,而无需切除碱基。例如光复活酶可被可见光(300-600 nm)激活,分解由于紫外线照射而形成的嘧啶二聚体。此酶广泛存在,但人体只存在于淋巴细胞和皮肤成纤维细胞,且是次要修复方式。

线粒体DNA的修复。Oxid Med Cell Longev. 2012; 2012: 282438.

线粒体DNA也需要修复。由于线粒体DNA与线粒体内膜非常接近,所以比核DNA更容易遭受氧化损伤。现已发现在线粒体中存在BER和MMR过程。

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