甲基化:给DNA戴上帽子

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导读

DNA甲基化是在DNA甲基化转移酶(Dnmt)的作用下将甲基选择性地添加到胞嘧啶上形成5-胞嘧啶的过程,刚被发现时被定义为第五种碱基,实际上它是一种重要的表观遗传学标记,在调控基因表达、维持染色质结构、基因印记、X染色体失活以及胚胎发育等生物学过程中发挥着重大的作用。它就像DNA的一顶最神奇的“帽子”,带给世人层出不穷的惊喜…

RNAi机制

DNA甲基化与遗传物质的稳定性

在生物个体的生长发育与繁殖过程中,维持遗传物质的稳定性是至关重要的。细胞采用多种机制来保证DNA复制的忠实性,如DNA的双螺旋结构与半保留复制模式为遗传物质的稳定提供了物质基础;DNA聚合酶Ⅲ除了具有DNA聚合酶活性外还具有5’到3’的核酸外切酶活性,可及时去除错配掺人的碱基;DNA复制后存在多种修复机制进一步保证了遗传物质的稳定性。DNA甲基化在DNA复制起始、错配修复、细菌中寄主控制的修饰与限制以及转座子的失活等过程中对维持遗传信息的稳定性发挥着重要的作用。

DNA甲基化与基因表达调控

在真核生物基因组中,基因仅仅占一小部分,例如在人类基因组中基因的编码序列还不到2%,那么在大量非编码DNA存在的情况下,实现精确控制基因的表达,降低周围的转录噪音对生物体至关重要。DNA甲基化作为一种可遗传的修饰方式为非编码DNA(内含子、重复元件以及潜在的具有活性的转座子)的长期沉默提供了一种有效的抑制机制。DNA复制后胞嘧啶的甲基化会改变DNA的构象,使DNA的大沟无法与DNA结合蛋白正常结合,从而使这些非编码区长期保持无表达活性的状态。而有转录活性的基因可利用非甲基化的启动子来进行转录表达,即使在相邻的非转录区是高度甲基化的,其启动子仍然可以起始转录并被调控。

DNA甲基化与表观遗传学

过去人们一直以为遗传和环境两大因素共同决定生物体的性状,然而人们无法合理解释马和驴的正反交后代、同卵双胞胎差别以及x染色体失活等现象。1942年Waddington首次提出了表观遗传学(epigenetics)的概念,它针对研究基因型与表型的关系,使经典的孟德尔核内遗传规律无法解释的现象得到了合理而完美的解释。基因组表观遗传修饰主要包括DNA甲基化修饰与核小体中组蛋白的修饰等,使得被修饰DNA的空间结构发生改变或使染色体结构发生改变,导致基因的沉默或过度表达。这两种修饰都是在不改变DNA碱基种类与数量的前提下使生物体表型呈现出多样化。DNA甲基化对基因表达模式以及基因组稳定性均起着至关重要的作用,并在印迹基因与x染色体失活等典型的表观遗传现象中起重要作用。

DNA甲基化与胚胎发育

DNA甲基化作为一种可遗传的表观遗传修饰,在体细胞增殖过程中通过依赖于DNA复制的DNA甲基转移酶Dnmtl稳定地传递给子细胞。但在胚胎发育的不同时期,基因组范围内的DNA甲基化水平会发生剧烈的改变,改变最剧烈的阶段为配子形成期与早期胚胎发育阶段,甲基化模式在配子形成时已经建立旧1。DNA甲基化对胚胎正常发育和等位基因的选择表达至关重要。错误甲基化模式的建立将引起人类的疾病,如Prader-Willi综合征、Angelman综合征和脆性x染色体综合征等。

甲基化的检测方法

DNA甲基化是最早发现的基因表观修饰方式之一,真核生物中的甲基化仅发生于胞嘧啶,即在DNA甲基化转移酶(DNMTs)的作用下使CpG二核苷酸5’-端的胞嘧啶转变为5’-甲基胞嘧啶。DNA甲基化通常抑制基因表达,去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。这种DNA修饰方式在不改变基因序列前提下实现对基因表达的调控。脊椎动物DNA的甲基化状态与生长发育调控密切相关,比如在肿瘤发生时,抑癌基因CpG岛以外的CpG序列非甲基化程度增加,CpG岛中的CpG则呈高度甲基化状态,导致抑癌基因表达的下降。

甲基化特异性的PCR(Methylation-specific PCR,MSP)

用亚硫酸氢盐处理基因组DNA,所有未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶不变;随后设计针对甲基化和非甲基化序列的引物进行PCR。通过电泳检测MSP扩增产物,如果用针对处理后甲基化DNA链的引物能得到扩增片段,则说明该位点存在甲基化;反之,说明被检测的位点不存在甲基化。

亚硫酸氢盐测序法(Bisulfite sequencing PCR,BSP)

用亚硫酸氢盐处理基因组DNA,则未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶不变。随后设计BSP引物进行PCR,在扩增过程中尿嘧啶全部转化为胸腺嘧啶,最后对PCR产物进行测序就可以判断CpG位点是否发生甲基化称为BSP-直接测序方法。将PCR产物克隆至载体后进行测序,可以提高测序成功率,这种方法称为BSP-克隆测序法。

高分辨率熔解曲线法(High Resolution Melting,HRM)

在非CpG岛位置设计一对针对亚硫酸氢盐修饰后的DNA双链的引物,这对引物中间的片段包含感兴趣的CpG岛。若这些CpG岛发生了甲基化,用亚硫酸氢盐处理后,未甲基化的胞嘧啶经PCR扩增后转变成胸腺嘧啶,而甲基化的胞嘧啶不变,样品中的GC含量发生改变,从而导致熔解温度的变化

甲基化与肿瘤

DNA甲基化(DNA methylation)是指在DNA甲基化转移酶(DNMT)催化下,以S-腺苷甲硫氨酸为甲基供体,将活性甲基转移至DNA链中特定碱基上的化学修饰过程。哺乳动物基因组中,DNA甲基化多发生在CpG二核苷酸中的胞嘧啶的5位碳原子。DNA甲基化是一种表观(epigenetic)修饰,它在不改变DNA序列的情况下,对个体的生长、发育、基因表达模式以及基因组的稳定性起到重要的调控作用,并且这种修饰在发育和细胞增殖的过程中是可以稳定传递的。近年来的大量研究表明,DNA异常甲基化与肿瘤的发生、发展、细胞癌变有着密切的联系。

DNA甲基化作为肿瘤生物标志物

DNA甲基化在肿瘤中的作用主要表现在以下几个方面:一是甲基化的CpG岛二核苷酸中的胞嘧啶以较高的频率脱氨基变成胸腺嘧啶,造成基因突变;二是抑癌基因和DNA修复基因由于超甲基化而沉默;三是癌基因甲基化水平降低而活化;四是基因组总体甲基化水平降低使转座子、重复序列活化导致染色体稳定性下降。这些因素是导致肿瘤发展、转移、恶化最终导致患者死亡的重要原因。DNA总体甲基化水平(即甲基化谱)和特定基因甲基化程度改变可作为肿瘤诊断指标。

甲基化与肿瘤侵袭和转移

DNA甲基化在肿瘤转移过程中发挥着重要作用,如有研究发现了数个可以诱导EMT的转录因子,在正常细胞中它们表现为高甲基化水平因而其表达受到抑制,但在肿瘤细胞中它们的甲基化水平偏低而出现高表达。利用DNA甲基转移酶(methyltransferase)抑制剂5-氮杂胞苷(5-aza-cytidine)处理MCF-7乳腺癌细胞,使其维持低甲基化状态,结果显示与EMT过程相关的促细胞侵袭基因(pro-invasive EMT-associated gene)表达上调,细胞的侵袭能力和转移能力增强。此类研究结果值得我们深思,采用DNA甲基转移酶抑制剂来治疗肿瘤固然可能抑制原癌基因的表达,但也可能造成肿瘤细胞转移播散增加的风险。

甲基化与肿瘤治疗

肿瘤预防和治疗的一个手段是通过去甲基化恢复某些关键的抑癌基因或DNA修复基因的活性,目前研究最多的是DNMTs抑制剂,它通过抑制DNMT活性以逆转异常的DNA甲基化。第一个表型修饰药物为5-azacytidine及其类似物5-aza-2′-deoxycytidine(5-aza-CdR),这类药物已经美国FDA批准用于白血病前骨髓增生异常综合征的治疗。5-aza-CdR是胞嘧啶的类似物,在DNA复制过程中可以掺入到DNA链中,一方面它可以降低DNA接收甲基的能力,另一方面它抑制DNMT活性,导致DNA甲基化水平的降低。体外和体内试验均表明,5-aza-CdR具有降低超甲基化的抑癌基因甲基化水平从而抑制肿瘤的能力,临床表明应用5-aza-CdR可提高部分IV期小细胞肺癌患者生存率,但该药也存在着不可忽视的毒副作用(如特异性不强,不能针对某一特定抑癌基因进行靶向治疗;高剂量的5-aza-CdR可能诱发肿瘤的转移),因此其在临床上的应用受到了很大限制。也有研究表明,低剂量的As2O3可起到治疗肝癌的目的。

甲基化研究前沿

突破性测序技术绘制甲基化图谱

美国科学家通过一种称作单分子实时(SMRT)DNA测序的新技术,研究人员首次绘制了致病菌全基因组甲基化标记图谱。通过比较相关菌株之间的甲基化模式,他们发现了称作噬菌体的病毒感染细菌显著改变宿主的一种方式。进一步研究对改变大肠杆菌特性至关重要的甲基基团将有助于研究人员了解甲基化对细菌生命周期、传染力、甚至或许是耐药性的作用。

信使RNA中存在高水平的甲基化现象

康奈尔大学的研究者发现,信使RNA—DNA的镜像拷贝,指导蛋白质合成—也会发生甲基化。对大鼠的各种组织进行分别的分析之后发现,甲基化的RNA集中在大脑、肝及肾脏中。并且,来自大鼠胚胎的样本分析表明,当胚胎大脑进入到生长的后期时,这种RNA的浓度上升了70倍,从而说明这些甲基化RNA很可能在发育中发挥基本作用。基化的腺嘌呤容易成簇出现在RNA链上蛋白质合成完成的位点,其他的蛋白质结合到这个区域改变或终止蛋白质的生产。这就表明,这种甲基化可能发挥着指导蛋白质合成时机及合成量的作用。

机体存在DNA主动去甲基化调控机制

浙江大学生命科学学院细胞与发育生物学研究所的研究人员以间充质干细胞成骨分化为实验模型,中证实机体存在DNA主动去甲基化调控机制,生长阻滞与DNA损伤诱导蛋白Gadd45a在该过程中发挥了关键作用。研究发现,Gadd45a介导的成骨基因表达的去甲基化调控主要发生于启动子的CpG岛外(island shore)中等密度区,而非通常认为的高密度CpG岛,而且Gadd45a介导的主动去甲基化主要发生在若干特定的CpG位点上。从而提出在DNA主动去甲基化过程中可能存在一种位点特异性去甲基化机制。

DNA去甲基化机制研究发现一种新的修饰碱基

中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所的工作证明,DNA中的5mC和5hmC都可以被Tet家族的双加氧酶进一步氧化为第7种碱基:5-羧基胞嘧啶(5caC);此外,胸腺嘧啶DNA糖基化酶(TDG)可以特异性地识别这一新的碱基修饰形式,并将其从基因组中切除。

附文,近期甲基化研究的实际运用:

Nature子刊:热量限制为何能延长寿命?——让表观遗传漂变“减速”

早在一个世纪前,科学家们就发现,减少热量摄入可以显著延长某些动物物种的寿命。近年来,越来越多的研究也表明禁食疗法或热量限制的健康益处。然而,这背后的生物学机制是什么,科学家们仍然不清楚。近日,坦普尔大学(LKSOM)刘易斯•卡茨医学院(Lewis
Katz School of Medicine)的研究人员已经突破了这一障碍。在9月14日发表于Nature Communications上的新文章中,他们首次阐明伴随衰老的表观基因组变化速率与多个物种的寿命有关,而卡路里限制减缓了这一变化过程,这或许能够解释热量限制对寿命的影响。

“我们的研究表明,表观遗传漂变,比如随着时间基因组DNA甲基化水平上升或下降,在不同物种中发生的速度不一样,小鼠最快,其次是猴子,最后是人类。”
LKSOM的医学博士Jean-Pierre Issa解释说。这些发现有助于解释为什么小鼠平均寿命只有2到3年,恒河猴约25年,人类却能活到70或80岁。

诸如DNA甲基化一类的化学修饰控制着哺乳动物的基因,它就像一个书签标记着基因应该何时被使用——这种现象被称为表观遗传学。“甲基化模式在整个生命周期中稳定地漂变,在基因组的某些区域增加,而在其他区域则减少。”Issa博士说。以前的研究表明,这些变化随着年龄的增长而发生,但它们是否与寿命有关还不得而知。

甲基化水平随年龄改变,并影响寿命

Issa博士的研究小组检查了小鼠、猴子和人类不同年龄个体血液中DNA的甲基化模式。小鼠年龄从几个月到三年不等,猴子从不到一岁到30岁不等,而人类从0岁到86岁(脐带血被用来代表0岁)。通过深度测序技术,他们分析了与年龄有关的DNA甲基化变化,揭示了不同的甲基化模式:在年龄较大的个体中增加的甲基化基因组位点在年轻个体中并没有甲基化。

在随后的分析中,研究人员发现,随着衰老甲基化增加的基因区域,基因表达发生了显著的下降,而甲基化程度降低的区域,基因表达增加。在调查了一系列受年龄相关的甲基化影响的基因后,研究人员发现了甲基化漂变与寿命之间的反比关系。换句话说,表观遗传变化的越大,发生的越快,物种的寿命就越短。

同物种与年龄有关的遗传漂变。图片来源:Nature Communications

热量限制影响甲基化漂变速率

“我们的下一个问题是,表观遗传漂变是否可以改变从而延长寿命,” Issa博士说。延长动物寿命的一个最有效的方法之一是卡路里限制(但仍然保持必需的营养摄入)。为了检验其效果,研究人员将年轻小鼠的卡路里摄取量减少40%,中年猴子减少30%。在这两个物种中,研究人员都观察到表观遗传漂变的显著减少,例如,卡路里限制饮食的衰老动物中,年龄相关的甲基化变化与年轻动物的变化相当。

根据最新的发现,Issa博士和他的同事们提出这样一种新机制——延缓表观遗传漂变——来解释卡路里限制如何延长动物的寿命。他说:“几十年来,卡路里限制对寿命的影响已经为人所知,但多亏了现代的定量分析技术,我们才能够首次发现显,随着寿命的增加,表观遗传漂变的减缓。”

这些发现对健康研究有重要意义,最近的研究表明,更多的表观遗传漂变增加了与年龄相关的疾病,包括癌症的风险。“我们的实验室首先提出了改变表观遗传漂变的想法,以此来改变疾病风险,”
Issa博士说,“但是,为什么有些人的表观遗传漂变速度更快,而另一些人的速度却更慢,这还不清楚。”

Issa博士的团队希望能尽快确定影响甲基化漂变的其他因素。或许可以通过调节这些因素来延缓漂变,对与年龄有关的疾病预防有重大影响。

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