厉害了!长寿蛋白SIRT6可促进脂肪燃烧,预防脂肪肝

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肥胖、2型糖尿病、脂肪肝等代谢性疾病正在成为21世纪的流行病,它们在公共卫生和经济成本方面对社会的影响是巨大的。20191217日,cell子刊Cell Reports报道了巴伊兰大学Haim Y. Cohen教授团队的研究“SIRT6 Promotes Hepatic Beta-Oxidation via Activation of PPARα”,论文证明长寿蛋白SIRT6在促进脂肪燃烧、调控肝脏脂肪代谢中起着重要作用。

研究背景:Sirtuins是一类NAD+(脱氢酶的辅酶)依赖性去乙酰化酶家族,具有调节寿命和年龄相关代谢性疾病的作用。在7种哺乳动物Sirtuins中,SIRT6被证明可以调节寿命和各种生理途径,包括胚胎发育、DNA修复、转座子稳定性、碳水化合物、胆固醇和脂肪的代谢、炎症、昼夜节律、癌症和衰老等。灵长类动物中SIRT6的缺失或人类中SIRT6的失活突变是致命性的,而转基因(TG)小鼠中SIRT6的过度表达则能增加雄性的寿命。在小鼠和灵长类动物模型中都被认为可以延长寿命的卡路里限制(CR)会增加SIRT6水平。这表明SIRT6可能介导CR的有益作用。SIRT6还被发现肝特异性KO会导致肝脂肪变性增加和β氧化降低。然而目前对于SIRT6β氧化方面的了解仍然有限。
PPARα是一种过氧化物酶体增殖物激活受体亚型,是肝脏β氧化的关键转录因子。在禁食等需要脂肪酸氧化的条件下,PPARα会通过上调脂肪氧化所需酶(CPT1α)的表达来确保能量的有效性。一旦被激活,PPARα会促进脂肪酸的β氧化,释放游离脂肪酸,从而增加乙酰辅酶A的生成。除了在β氧化中的直接作用外,PPARα还通过激活PDK4抑制糖酵解衍生的丙酮酸氧化,并通过增加乳酸和丙氨酸等糖异生前体间接地推动肝脏向脂质氧化。此外,PPARα被证明可以抑制SREBP介导的胆固醇和甘油三酯的合成。
PPARαSIRT6都与肝脏β氧化、炎症和昼夜节律调节有关,在饥饿或CR条件下,它们的活动都增强。这些发现表明,SIRT6PPARα之间可能存在协同调节的相互作用。
 
研究内容:研究者们先对WTSIRT6杂合子(HZ)小鼠(SIRT6缺乏)肝脏进行基于RNA测序(RNA-seq)的定量转录组分析,对高差异表达(DE)基因进行qpcr验证,结果发现,HZ小鼠中被差异调节的前三条通路都与β氧化直接相关。IPA分析发现作为β氧化的中间步骤,酰基辅酶AAcyl-CoA)水解是最显著的调节途径。排名第二的途径是甘油三酯降解,这一步甘油三酯水解成脂肪酸,用于β氧化。第三个途径,硬脂酸生物合成,涉及到饱和脂肪酸的合成。已被确定为DE基因的上游调节因子的PPARα也受到最显著的抑制。结果显示SIRT6PPARα都位于脂质代谢网络的中心位置,这表明这两种蛋白在调节脂肪代谢方面可能相互协调。此外,使用ExpressionBlast工具将HZ的肝脏DE基因与当前GEO数据库中的所有微阵列进行比较,发现前三名的高度显著性匹配为PPARα KO微阵列,这表明SIRT6 HZ小鼠的基因表达谱与PPARα KO小鼠极其相似。这些发现强烈提示SIRT6激活PPARα

为了探讨SIRT6激活PPARα信号的机制,研究者们先检测了WT HZ小鼠的PPARα水平和乙酰化水平。PPARαmRNA水平二者类似,在PPARα上没有检测到乙酰化。因此作者又猜想二者是否存在物理上的相互作用,结果显示无论是内源性还是外源性的PPAR都可以与SIRT6 发生免疫共沉淀,表明SIRT6PPARα特异性结合。利用微流体蛋白结合平台定量显示SIRT6PPARα的结合亲和力明显高于HIF1a(已知的SIRT6相互作用蛋白),表明PPARαSIRT6之间存在很强的相互作用。为了检测SIRT6是否与PPARα相互作用的DNA反应元件—— PPRE直接结合,以及这种相互作用是否需要PPARα,研究者们使用了(QPID)微流体法,结果显示在PPARα存在的情况下,SIRT6PPRE的结合显著而强烈,但对突变的PPRE序列的亲和力不明显,这些发现表明SIRT6以一种PPARα依赖的方式与PPRE特异性结合。荧光素酶报告基因检测同样显示在体内SIRT6可以激活PPRE,且这种反应SIRT6酶活性是必需的(无催化活性的突变体SIRT6 H133Y无法激活PPRE的转录活性)。此外,在SIRT6过表达细胞中,PPARα过表达可进一步诱导PPRE。因此,这两种蛋白可能协同激活PPRE。这些数据表明,SIRT6通过PPARα直接激活PPRE

由于SIRT6被发现与PPRE结合(上图),作者于是研究了SIRT6对各种肝脏PPARα信号通路转录的影响。先前已有研究证明,经WYPPARα激活剂)处理后,小鼠肝脏和原代肝细胞中均能观察到PPARα转录的强烈诱导,这些途径包括线粒体β氧化、过氧化物酶体β氧化、酰基辅酶A结合/水解、脂质储存/运输和酮生成。在本实验中,SIRT6 HZ的原代肝细胞始终显示PPARα激活减少。相反,与WT相比,SIRT6 TG小鼠(SIRT6过表达)在原代肝细胞中显著增加了PPARα的诱导。体内实验也是类似结果。有趣的是,正如之前在小鼠而非原代肝细胞中所显示的,脂质转运基因Slc27a1可经由WY处理诱导, SIRT6进一步激活了该基因。此外,SIRT6还增加了Fgf21的表达,这是PPARα活性的一个关键因素。这些结果表明,SIRT6在多种途径上促进了PPARα依赖的转录活性。

随后,作者又检测了SIRT6对一系列PPARα调控途径下游的影响,包括β氧化、糖异生和甘油运输,以及抑制糖原分解和丙酮酸代谢的能力。实验发现,经过WY处理后,HZ小鼠的PDK4P-PDC蛋白水平(丙酮酸氧化),Cd36RNA水平、长链脂肪酸氧化产物乙酰肉碱代谢物水平、最终产物CO2水平(脂肪酸β氧化),甘油转运蛋白Aqp3RNA水平、乳酸和丙氨酸代谢产物均显著下降,以往研究证明WY处理可抑制糖原分解基因Pygl的表达,激活糖原合成基因Gys2,但这种效应在HZ小鼠中几乎完全消失。
HZ小鼠相反,在禁食条件下,SIRT6 TG小鼠中SIRT6过表达导致了丙酮酸水平显著升高,丙酮酸氧化受到抑制,β氧化代谢物乙酰肉碱升高。此外,饥饿的TG小鼠甘油水平显著升高。这些代谢物的变化与丙酮酸氧化抑制剂Pdk4β氧化激活剂Cpt1aAcot3Ehhadh基因和脂质存储基因Gos2的转录显著增加有关。总之,这些数据表明,SIRT6激活广泛的PPARα信号通路,调节代谢,最终增加β氧化。

为了证明SIRT6PPARα信号的影响存在PPARα依赖性,使用两种不同的 siRNAs敲除PPARα (KD),与对照组相比,PPARα KD Hepa1-6细胞中PPRESIRT6激活、β氧化基因丙酮酸信号均被显著抑制。表明PPARα介导SIRT6对多个PPARα信号通路的影响。

既往研究表明PPARα的诱导会强烈抑制SREBP1 /2介导的转录。作者使用与前文类似的方法证明了SIRT6调控PPARα抑制的SREBP依赖的胆固醇合成。然后作者研究了SIRT6调节PPARα介导的SREBP抑制的生理效应。NMR分析显示WY处理显著降低肝脏脂肪含量近50%SIRT6 TG小鼠中,这种脂肪减少显著增强。而在HZ小鼠中则被抑制,且β氧化减少。这些发现表明,在需要激活PPARα的更广泛条件下,SIRT6将能源利用导向脂肪。

SIRT6是组蛋白去乙酰化酶,通常会导致转录水平降低。作者于是研究了SIRT6激活PPARα的潜在机制是否通过其辅激活物或辅抑制物的去乙酰化。利用SILAC质谱分析发现只有一种蛋白,即已知的PPARα共激活因子NCOA2,在TG小鼠中显示出显著降低的乙酰化水平。且SIRT6可以与NCOA2相互作用。将NCOA2 K780突变为精氨酸(K780R)或谷氨酰胺(K780Q)(二者皆为去乙酰化NCOA2),PPRE的激活显著增强,表明SIRT6通过NCOA2去乙酰化激活PPARα依赖的信号通路。

总结这篇文章,促长寿酶SIRT6可结合PPARα及其在启动子区域的反应元件(PPRE)激活基因转录。SIRT6缺乏会显著降低PPARα诱导的β氧化及其代谢物,降低丙氨酸和乳酸水平,同时诱导丙酮酸氧化。此外,SIRT6介导PPARα抑制的SREBP依赖的胆固醇和甘油三酯的合成。SIRT6PPARα辅激活因子NCOA2结合,减少后者的乙酰化,从而激活PPARα。本文揭示了SIRT6与各种代谢途径的相互作用,并提示了SIRT6维持肝脏健康的新机制。下图的漫画可形象地总结全文。本文通讯作者科恩教授说:“通过与PPARα协同工作,SIRT6可以向身体发送信号,以燃烧更多的脂肪(特别是在肝脏中)。”

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