【重磅综述】成体干细胞稳态与衰老的昼夜节律调控

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翻译 By 孙晓燕 单贺珍 杨萍

昼夜更替,四季轮回,身在地球村里的每个人都逃不开自然的周期变化。常言道:日出而作,日落而息; 春争日,夏争时。自然周期变化不仅影响着人们的生活和劳作,更是对个体生理健康至关重要。然而如今,越来越多的年轻人想要“打破自然周期”,成了“熬夜君”。经常熬夜的你可能还不知道昼夜节律对生理健康到底有什么影响。这一期,我们就来说一说昼夜节律与成体干细胞衰老之间“错综复杂”的故事儿。本篇综述是西班牙巴塞罗那生物医学研究所Salvador Aznar Benitah团队于2020年5月发表在Cell Stem Cell杂志上,题为“Circadian Regulation of Adult Stem Cell Homeostasis and Aging”的文章,详细介绍了成体干细胞的昼夜节律调控机制,以及成体干细胞衰老与昼夜节律调控之间的复杂关系。

 

通讯作者:Salvador Aznar Benitah
(图片源于网络)
 

摘要

昼夜节律能够实时调控细胞的生理活动,预测每日环境的变化并及时抑制潜在的有害生理过程。通过在组织水平同步所有细胞,昼夜节律可以确保机体一致的时间生理特性。有关成体干细胞生理特征的最新研究表明,干细胞衰老与昼夜节律紊乱紧密相关。本篇综述讨论了昼夜节律如何调节和同步化成体干细胞的功能,以及衰老过程中昼夜节律变化调控成体干细胞稳态的外在和内在机制。
 

引言

地球绕其轴心自转形成了24小时的昼夜周期变化,造成了光照(白天和黑夜)、温度、食物可获得性和捕食者活动等的变化,地球上的各种生命个体也必然受到这些变化的影响。这些生命个体进而发展出了可以感受并适应时间变化的节律机制,这些机制遵循以下原则:(1)它们使生物体对一天内时间信号的变化作出响应,即所谓的环境钟提示(Zeitgeber cues,Zeitgeber在德语中为“时间给予者(time giver)”的意思);(2)它们能够形成周期大约为24小时的昼夜节律振荡(“circadian”源自拉丁文circa diem,“大约一天”的意思);(3)即使在没有外源昼夜变化的情况下,它们也能维持自我建立的昼夜节律振荡,从而使它们能够根据时间预测生物体的生理状况。
 
哺乳动物昼夜节律时钟由受转录/翻译反馈回路调控的复杂转录振荡器网络组成。昼夜节律转录因子(transcription factor, TF)复合物BMAL1(brain and muscle ARNT-like 1)/CLOCK(circadian locomotor output cycles kaput)可以结合E-box元件以激活时钟控制基因(clock-controlled genes,CCGs)的转录。CCGs包括period (Per)和cryptochrome (Cry),它们的蛋白质产物会反过来抑制BMAL1/CLOCK的转录活性(包括其自身的转录)。PER和CRY经蛋白酶体降解会解除对BMAL1/CLOCK复合物的抑制作用,触发新一轮的转录周期。此外,BMAL1/CLOCK可以从转录水平促进核受体亚家族1 D组成员1(nuclear receptor subfamily 1 group D member 1, Nr1d1或REV-ERBα)、成员2(Nr1d2或REV-ERBβ)以及视黄酸受体相关的孤儿受体(Retinoic Acid Receptor-related orphan receptor, RAR-ROR)家族的表达。REV-ERBα和REV-ERBβ能够抑制Bmal1的表达,而RORs能够激活Bmal1表达,因此REV-ERBα/β会与RAR-ROR竞争共享的DNA结合位点(此位点称为ROREs),进一步调节BMAL1/CLOCK复合物以及CCGs。与其他昼夜节律控制的TF(如D-box binding Protein Albumin Receptor Basic Leucine Zipper Domain TF,DBP)一起,昼夜节律时钟网络建立了CCGs的转录振荡(图1)。
 

 图1.昼夜节律与衰老相关的信号通路之间的分子网络连接
BMAL1和CLOCK构成了节律生物钟的核心TF复合体。许多正反馈和负反馈回路(如:PER、CRY、REV-ERB和ROR蛋白)建立了生物钟的昼夜节律性。且多个衰老相关的信号通路与生物钟紧密相关,如:营养感应途径(涉及mTOR、SIRT1和AMPK)、机械感应、TFs(HIF1α)。(黄色:节律生物钟的核心激活信号复合体;红色:BMAL1/CLOCK的负调节器;绿色:BMAL1/CLOCK正调节器;紫色:将衰老相关信号和昼夜节律调节联系起来的蛋白质。)
 
核心的节律机制能够在哺乳动物的大多数细胞中表达,并在除睾丸和胸腺外的所有周围组织中产生昼夜节律的转录振荡。通过同步化组织内所有细胞的时相状态,能够形成组织水平上的昼夜节律输出,这一过程称为“协同(entrainment)”。视网膜感知的环境光是主要的协同信号。这种光信号重置了下丘脑神经元簇(即视交叉上核,suprachiasmatic nucleus,SCN)的昼夜节律相位,后者又将信号传输到外周组织,并被作为中央时钟或起搏器。因此,损伤SCN会破坏节律性运动、节律性进食和饮水以及内分泌节律等。SCN为生物提供了昼夜节律的自主权,即能够预测而不只是响应周围环境变化的能力。特别是,通过整合直接信号(如体液信号和自主神经系统传导的神经信号)以及间接信号(如节律性静息活动、体温、氧气水平、进食周期等),它能够在恒定的黑暗条件下维持周围组织的昼夜节律同步。组织对不同的SCN依赖性协同线索具有不同的敏感性和动力学。此外,小鼠模型体内实验表明,当SCN受到解剖损伤、功能性遗传破坏后,或除SCN以外的任一组织中没有生物钟的情况下,某些组织仍能保持昼夜时钟同步(尽管振荡幅度较低)。因此,外周组织的昼夜节律协同可能不仅需要从SCN衍生的显性信号,而且还需要利用来自外周组织的系统性信号进行微调。
 
受核心生物钟转录机制特定的表观遗传背景以及谱系特异TF差异的影响,外周组织在同步时表现出高度组织特异性的昼夜节律输出。转录后和翻译后调节机制也有助于建立节律性基因表达,即使在转录水平没有节律变化的情况下。因此,昼夜节律性变化发生在多个调节层,包括转录组、蛋白质组、代谢组乃至微生物组。
 
 
成体干细胞的昼夜节律及其微环境
成体干细胞(stem cells,SCs)是能够自我更新,产生特殊细胞类型的多能细胞。在这里,作者总结了部分成体SC组分的昼夜节律性生理变化,以及昼夜节律在调节SC稳态和衰老中的意义。
 
  • 造血干细胞
造血干细胞(Hematopoietic SCs,HSCs)能够产生所有的血细胞谱系细胞,在稳态条件下处于静息状态,而其后代细胞,造血干/祖细胞(hematopoietic stem and progenitor cells,HSPCs)则负责维持造血过程中新细胞的高生成率。骨髓HSCs能够表达核心时钟机制的基因,但是,其核心时钟基因的转录振荡似乎基本不存在。
 
HSCs和HSPCs在静息阶段首先从骨髓进入循环系统(如小鼠和人),而后回到骨髓中。从机制上讲,其外出和返回取决于多个因素。首先,在骨髓中C-X-C基序趋化因子配体12(C-X-C motif chemokine ligand 12,CXCL12)的梯度表达能够作为表达C-X-C基序趋化因子受体4(C-X-C motif chemokine receptor 4,CXCR4)的HSCs的驻留信号。该机制依赖于由骨髓中交感神经系统(sympathetic nervous system,SNS)神经元释放的局部去甲肾上腺素激活的昼夜节律性β-肾上腺素信号,β-肾上腺素信号能够激活基质细胞中的SP1,从而导致CXCL12的节律性表达。HSPCs表面CXCR4的水平变化由核心昼夜节律机制控制。在循环系统中,中性粒细胞经历一系列衰老过程,这一过程受昼夜节律调节,老年中性粒细胞被骨髓中的巨噬细胞吞噬,从而促进HSPC进入循环系统。
 
其次,应激激素皮质酮的生理性昼夜节律振荡通过CXCL12和Notch1信号调节HSC/HSPC的增殖和迁移。然而,HSPC内在的节律似乎并没有增强HSPCs的增殖和分化潜能。相反,光亮和黑暗的周期确实能够通过HSPCs内部的肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)和去甲肾上腺素介导的代谢改变来调节HSPC的自我更新和分化。因此,尽管昼夜节律时钟网络对于HSPC进入循环系统并回到骨髓的每日周期变化至关重要,但昼夜节律时钟与HSPCs稳态和功能之间的相关性仍是难以捉摸的。
 
表1 年轻与衰老干细胞的昼夜节律时钟和昼夜节律功能

本表格总结了昼夜节律的功能以及年轻与衰老干细胞中生物钟失衡的后果。
 
  • 滤泡间表皮干细胞
滤泡间表皮干细胞(epidermal stem cells,EpSCs)拥有很强的自我更新和分化能力,以维持表皮组织的屏障功能。小鼠体内的EpSC,以及体外培养的人角质形成细胞都会发生核心时钟机制的振荡。同时细胞周期调控是滤泡间EpSCs最突出的循环调节功能之一,其中,处于S期的小鼠基底细胞百分比的最高峰在夜间出现。
 
表皮会经常暴露在有害因素中,比如紫外辐射、感染等。而为了保证机体在特定时间段内免受紫外线损伤,小鼠中的许多同DNA损伤修复相关的基因都会发生昼夜节律性的表达,不过,Bmal1敲除小鼠丧失了这种能力。此外,当DNA修复基因(如jetlag)处于低表达状态时,高强度的紫外线会显著性地增加皮肤DNA损伤,并易于发展为紫外线辐射介导的皮肤癌。
 
同样地,表皮和EpSC中许多代谢相关基因的表达也受到生物钟的控制。比如,从小鼠EpSC中NAD+与NADH的比率变化中便可窥得一二,氧化磷酸化水平在日间达到峰值,而糖酵解的峰值出现在夜间(小鼠常在夜间活动),但这些现象依赖于BMAL1的表达。值得注意的是,氧化磷酸化比率的增加同活性氧水平升高以及S期的基底表皮细胞减少是密切相关的。这种从氧化磷酸化到糖酵解的昼夜节律转变可能使EpSC根据时间将DNA复制与氧化磷酸化的峰值状态,以及紫外线的高暴露阶段划分开,从而降低二者对DNA复制的有害影响。
 
  • 毛囊干细胞
毛囊经历着反复循环的生长、静息和退化阶段,其中位于隆突区的毛囊干细胞(hair folliclel stem cells,HFSCs)主导着这一生物过程。尽管头发的生长周期要远大于24小时,但HFSC也是处于昼夜节律的调控之下的。例如,随着全身昼夜节律紊乱的小鼠慢慢长大,其毛囊生长期处于停滞状态。这很可能是由于Bmal1缺失引起的外界调控信号或年龄相关的损伤积累所致,因为毛囊周期循环在条件性敲除表皮Bmal1的年轻小鼠中是正常的。但是,年轻小鼠表皮的强迫性昼夜节律失衡会干扰HFSC和祖细胞中DNA复制的昼夜节律。这使得毛囊对遗传毒性应激的敏感性呈周期性变化,早晨受损风险增加,而晚上则较低。
 
有趣的是,核心时钟机制的成分在毛囊祖细胞中同质表达,而在膨大的HFSC(人和小鼠中)中却是非完整性表达的。这种不完整的表达与膨大HFSC对增殖分化调控信号的敏感性相关,这表明生物钟代表着HFSC不同的状态,并且这些状态对于增殖分化信号有着不同的响应倾向。
 
  • 肠道上皮干细胞
Lgr5+肠道上皮干细胞(intestinal epithelial stem cells,IESCs)位于隐窝基底部,隐窝较底层的转运-扩增细胞室为分化的组织细胞补充日常所需能量。Lgr5+IESCs散布在终末分化的分泌细胞(称作Paneth细胞)间,这些分泌细胞可以为IESCs提供养分,也是干细胞微环境的重要组成部分。
 
生物钟也控制着肠道的一些基本生理功能,例如组织再生、上皮-微生物群通讯、肠道通透性、应对感染和炎症反应的免疫响应以及身体构成。令人意外的是,体外培养的肠道3D类器官在没有外部同步信号调控下,也发生了同步的昼夜节律变化,非分裂细胞表现出强烈的昼夜节律转录周期,而IESC与祖细胞中的Per2报告基因仅发生微弱的转录振荡。在IESC中,Paneth细胞生物钟通过细胞间的WNT信号控制细胞分裂。因此,细胞间的偶联(通过分泌因子)不仅会使类器官内不同细胞之间以及不同类器官之间的生物钟转录振荡同步,可能还会使SCs和祖细胞中的细胞分裂周期同步。
 
不过,仍然还存在着一些争议问题,比如IESC是否缺少功能性的生物钟“发条装置”,或者与之相反,体内稳态下IESC是否拥有增殖性节律?尽管如此,在应对辐射的再生反应中,肠道上皮细胞增殖是符合Bmal1依赖性的昼夜节律周期变化的。然而由于体外对细胞增殖周期与体内对内在稳态与再生条件的不同调控,其结果不尽相同。比较有意思的是,果蝇IESC的核心时钟成分也存在着转录振荡,这似乎取决于与微环境的信号交流。
 
  • 神经干细胞
不同类型的相对静息神经干/祖细胞(neural stem and progenitor cells,NSPCs)位于不同的大脑区域(包括海马齿状回[DG]的亚颗粒区[SGZ]和紧邻侧脑室的前脑室下带[SVZ]),其时钟基因的昼夜节律行为会有些不同。比如,小鼠SGZ内的一些核心时钟蛋白会在静息态NSPC中发生振荡,而在增殖期的NSPC(神经发生过程)中停止,并在神经元成熟后再次拥有昼夜节律性。此外,在取自SVZ或DG的神经干细胞的神经球培养物中,Per1报告基因仅在分化时出现稳定的昼夜节律变化。这表明在不同的SC阶段,时钟的功能可能有所不同。最后,NSPC增殖期间的昼夜节律仅发生在大脑的某些区域,并非全部。比如,尽管SGZ和SVZ中的脱氧尿苷阳性NSPC在S期中并不同步,但在DG中可观察到M期NSPC的昼夜节律变化,这表明NSPC的有丝分裂也受生物钟的调控。
 
尽管目前对NSPC内在的生物钟转录输出和生理相关性知之甚少,但已经发现一些核心时钟基因可以调控神经的发生。例如,BMAL1缺失会促进年轻小鼠NSPC的增殖,并导致生命后期的干细胞衰竭。此外,在时差反应期间,昼夜节律与外部环境的不平行会抑制神经的发生。不过,尚有几个问题有待解决,包括时差介导的神经发生抑制是否依赖于NSPC生物钟,以及微环境的昼夜节律信号与NSPC内在“时钟发条“的信号对神经发生与NSPC生理状态有何影响。值得注意的是,NSPC微环境中的多种神经递质和糖皮质激素(如,皮质醇、多巴胺、5-羟色胺、γ-氨基丁酸和谷氨酸)发生昼夜节律相关的浓度变化。因此,微环境中的生物钟似乎也影响着神经干细胞的生理状态。
 
  • 骨骼肌干细胞
骨骼肌干细胞(也称作卫星细胞)是与肌纤维紧密相关的长期静止细胞,它主要在损伤刺激时活化。卫星细胞在体内会发生核心时钟机制的强烈振荡。重要的是,昼夜节律的输出涉及卫星细胞稳态所需的途径,例如那些调节静息态、活化准备(比如转化生长因子β/骨形态发生蛋白和成纤维细胞生长因子信号)、细胞骨架以及自噬的信号通路。
 
BMAL1也与肌肉发生和卫星细胞维持有关。不过和神经发生以及EpSCs不一样的是,BMAL1缺失不能促进WNT信号下游调控的成肌细胞分化。此外,BMAL1似乎可以直接或间接调节MyoD的表达,MyoD是肌肉生成的关键调控者,导致Bmal1基因敲除小鼠骨骼肌的肌丝结构受到损伤。
 
总而言之,生物钟可能是通过控制卫星细胞的静止与活化准备沿着适当的时间轴发生,从而影响卫星细胞的生理状态与维持。
 
  • 成体干细胞微环境中的昼夜节律系统信号
成体干细胞可以接收来自局部微环境或系统的提示信号,包括神经、体液和代谢信号,从而受到生物钟网络的调控。接下来,将简要总结一下那些可能调控成体SC功能的昼夜节律系统信号。
 
依赖SCN的自主神经信号可以调节肾上腺功能,并影响糖皮质激素的分泌。重要的是,依赖SCN的神经信号传导同多种成体干细胞的微环境相关,比如毛囊和HSC室。因此,自主信号可以调节成体干细胞生物钟与生理状态。
 
生物钟网络控制着多种激素,包括褪黑激素和糖皮质激素,这些激素有助于同步化外周组织的生物钟。同局部外周组织的生物钟相一致,SCN通过松果体调节褪黑激素水平以及通过下丘脑垂体肾上腺轴调控糖皮质激素(例如皮质醇)的水平。褪黑激素将环境中光亮的变化信号传递给周围组织的生物钟,从而调节睡眠状态,并影响血管反应性并充当抗氧化剂。有趣的是,褪黑激素可以影响神经干细胞的增殖和分化,并调节间充质SC的分化。
 
糖皮质激素对于机体的应激反应非常重要。糖皮质激素水平基线呈现出昼夜节律变化,并在生物体的活动阶段达到最大水平。糖皮质激素通过转录和非转录途径发挥作用,可以影响能量代谢、脂质代谢以及炎症。糖皮质激素信号传导牵涉到多种组织的SC和祖细胞增殖,例如,小肠、肺和表皮。值得注意的是,糖皮质激素的昼夜节律同海马区DG的神经SC激活以及静息态神经SC库的维持相关。
 
大多数代谢途径会受到生物钟网络的控制。最新的代谢组学研究表明,生物钟网络不仅让许多代谢物发生昼夜节律振荡,而且有助于按照时间轴协调不同器官间的组织内在代谢组。尤为重要的是,高脂饮食和饮食限制会改变成体SC以及整个器官水平的昼夜节律相关的转录输出。因此,生物钟网络控制着局部和全身的新陈代谢水平,并影响成体SC的生理状态。
 
成体干细胞的衰老过程与昼夜节律
在衰老过程中,成体SC数目和功能的减退会导致再生能力下降,并引起组织稳态的失衡。生物钟和昼夜节律不仅同成体SC稳态有关,而且还与其他一些诱发衰老的过程交织在一起,例如表观遗传调控、营养感应、线粒体功能和细胞间通讯。几种衰老的标志物反过来也能影响生物钟的正常运转。在哺乳动物中,生物钟紊乱会增加罹患多种疾病的可能性,缩短寿命期,比如癌症。此外,人为诱发的慢性时差反应可以增加小鼠的死亡率。文章在这里讨论了衰老相关的昼夜节律功能改变是如何负面影响成体SC功能并促进衰老的。
 
  • 衰老的系统生物钟网络
随着衰老进程,SCN在同步化外围组织时钟中的主导作用受到多种影响。例如,由于晶状体透光率降低,即将光信号传递给SCN的固有感光视网膜神经节细胞数量减少,老年动物对光的捕获和响应灵敏度降低,并且SCN本身也发生了功能减退。SCN中的总细胞数似乎随着年龄的增长而不变。不过,小鼠和人类中的老化SCN中表达神经递质血管活性肠多肽(vasoactive intestinal polypeptide,VIP)的神经元较少,其中VIP是SCN神经元之间细胞偶联的重要介体。老化的SCNs还会表现出神经元间的胞间偶联以及突触末端数量减少。因此,光输入敏感性、信号传递以及神经网络内的细胞偶联的不断降低会导致衰老SCN光反应性的减退。很显然,衰老SCN的功能退化会极大地缩短寿命,而将SCN从年轻供体移植到老年仓鼠受体中,可将其寿命延长近20%。
 
衰老以基因特异性的方式影响SCN中核心时钟基因的表达。例如,尽管在衰老SCN中,Bmal1和Per2的总蛋白水平降低,但其他时钟基因的表达或周期延长并未发生变化,不过老年SCN神经元内信号的昼夜节律幅度会降低。尽管尚不清楚这些明显变化的功能相关性,但它们很有可能会导致衰老相关的SCN依赖的昼夜节律输出减少,比如运动幅度降低和光周期适应性降低、睡眠-觉醒周期减少、体温循环减慢、神经活动节律和体液节律受损。
 
  • 干细胞微环境与系统信号中的衰老与昼夜节律
干细胞微环境中的一些衰老相关的变化是受生物钟网络调节的,或影响微环境中的生物钟节律。衰老的ASC微环境中的神经信号可能受到损坏,衰老外周组织中对去甲肾上腺素能刺激与肾上腺素能受体mRNA表达下调的反应变弱。老年小鼠血液中的HSPC水平的昼夜节律振荡丧失以及SPC衰老依赖于HSPC微环境的交感神经支配和β-肾上腺素能信号的减少,不过HSPC衰老是否也依赖于SCN的昼夜节律对于交感神经的控制力减弱,还有待证实。
 
此外,HFSCs的光依赖性活化取决于SCN控制的交感神经支配和皮肤中去甲肾上腺素的释放,但似乎与SCN介导的身体活动节律变化无关。因此,衰老相关的SCN功能下降和SCN下游信号传输受损可能是通过HFSC微环境中的昼夜节律来促进HFSC的衰老。
 
据报道,褪黑激素和糖皮质激素(例如皮质醇)的昼夜节律振荡随着年龄的增长而衰减。但是,这可能只发生在人类的非健康衰老过程中。褪黑激素不仅是昼夜节律系统中主要的同步因子,而且具有显著的延缓衰老特性。将幼鼠松果体移植到老年鼠中,可以延长其寿命。并且褪黑激素可以调节抗氧化酶的表达与活性,是一种自由基清除剂。褪黑激素还能够促进造血功能,保护造血系统免受自由基、辐射诱发的损伤与细胞毒性药物的损害;并保护培养的HSPC免受化学疗法的毒性。最后,褪黑激素补充剂可以促进老年小鼠和体内脊髓损伤后的神经发生,并促使体外NSPC的增殖和分化。
 
老年大鼠体内糖皮质激素水平的升高与海马神经发生减退,以及衰老相关的记忆障碍相关。糖皮质激素的生物钟振荡则同海马区干细胞群体的保存相关。然而,激素信号的昼夜节律振荡是否以及如何影响衰老SC微环境仍有待确定。
 
除了改变昼夜节律对系统因素的控制外,衰老相关的局部变化也可能对ASC功能产生负面影响。例如,细胞外基质(extracellular matrix,ECM)硬度的机械敏感性可以调控乳腺上皮SC,表皮角质形成细胞和肺上皮细胞中生物钟的振荡幅度。由于乳腺组织中的ECM硬度会随着年龄的增长而增加,因此在取自老年小鼠的组织外植体中,乳腺上皮细胞的昼夜节律振荡幅度会降低。不过,这一现象是否也存在于体内还尚待证实。
 
此外,由昼夜节律时钟在局部微环境中细胞产生的信号可能会影响ASC生理的时间轴结构。据报道,小鼠大脑非SCN区域中的某些核心时钟蛋白(如BMAL1、CLOCK)的振荡(主要是振幅,也有相位)会随着年龄的变化而变化,以及在肝脏和胰腺中的RNA水平也会发生衰老相关的改变。然而,令人意外的是,许多衰老组织的核心昼夜节律机制的振荡几乎没有发生变化,比如肝脏、心脏、松果体、下丘脑的室旁核、肺、结肠、肾脏、下颌下腺、表皮以及毛囊。因此,至少在大多数非应激条件下的外周组织中,生物钟在衰老过程中似乎相对稳定。然而,当受到光的相移这一刺激时,同年轻大鼠相比,老年PER1 :: LUC报告基因大鼠的肝脏外植体相位重置反应发生改变。不过,这一发现并未在年轻与衰老SCN外植体得到重复。因此,光相位的变化可能会使老年个体不同组织间的生物钟失调。值得注意的是,在缺少同步光信号的情况下采集组织,一些源自老年个体的外周组织(如肾脏,肝脏和下颌下腺)的外植体表现出PER2 ::-LUC报告子振荡的相移。这些结果表明,衰老降低了生物钟网络在组织水平上对于环境信号动态变化的响应能力。
 
  • 成体干细胞的衰老与昼夜节律
最近的一项研究揭示了一个悬而未决的科学问题,即在体内生理衰老过程中,ASC的生物钟是如何发挥作用的。有趣的是,在衰老的EpSCs和骨骼肌卫星细胞中,核心昼夜节律仍然保持完美的节奏。然而,在衰老的EpSCs和卫星细胞中只有一小部分CCGs在转录水平维持每日振荡,一些新的基因集则每日节律表达。在衰老的小鼠肝脏、人类前额皮质和果蝇的头部中也具有这一重编程的昼夜节律转录组。因此,这些研究建立了转录组的昼夜节律重编程作为在组织和ASC水平上衰老如何影响生物钟功能的新范式(图2)。这种与衰老相关的昼夜节律重编程的核心是在迄今为止研究的所有衰老组织和干细胞中观察到的,新的振荡节律输出总是与组织特有的压力有关。
 

图2.影响成体干细胞昼夜节律性的衰老相关变化
光透过率降低和固有的感光性视网膜神经节细胞(IpRGC)变性减少了对SCN的光输入信号。SCN的功能衰退进一步削弱了SCN的输出,包括较弱的睡眠-觉醒周期,代谢周期的改变,以及神经和体液输出的减少。在衰老的外周组织和ASC隔室中,同步信号的传递不那么有效,这是由于整体体力活动减少,ASC微环境的神经支配减少以及机械特性改变所致。虽然核心节律似乎在大多数衰老的外周组织中保持相当强劲的振荡,但同步提示的稳健性降低可能会降低外周组织对环境条件变化的反应能力。最后,老年小鼠成年干细胞的昼夜节律转录组的重新编程和昼夜节律性的改变也可能依赖于微环境相关线索的改变。
 
EpSCs是高度增殖的,并且主要在夜间复制其DNA,此时氧化磷酸化诱导的遗传毒性应激较低。与此一致,成年小鼠EpSCs中的振荡转录本在很大程度上参与了稳态功能,如DNA复制、分化和屏障功能。另一方面,老龄小鼠的EpSCs进入S期的时间延迟约8-12h,与氧化磷酸化达到最大值的时间一致。因此,在老年的EpSCs中,结构松散的DNA可能暴露在更高水平的基因毒性应激下,这可能是他们DNA氧化水平升高的原因之一。因此,衰老小鼠的EpSCs的振荡转录组与DNA修复、ROS反应和炎症过程有关。
 
与EpSCs不同的是,骨骼肌中的卫星细胞通常处于静止状态,因此不会经历复制压力。然而,许多参与调节卫星细胞静止功能的转录本,如肌管分化或TGF-β/BMP和FGF信号,在成年小鼠的卫星细胞中振荡。老化的卫星细胞仍保持静止,并保持转录本的节律性,这些转录本参与调节它们与微环境间的相互作用。然而,老年小鼠卫星细胞中新的振荡转录本涉及炎症和线粒体DNA修复的调节。重要的是,老化的卫星细胞显示出整体自噬水平的下降,参与自噬调节的转录本失去有节律的表达。
 
综上所述,衰老导致的ASC重编程的节律性输出,反映了单个干细胞区室内与衰老相关的特定组织条件。此外,在衰老的干细胞中,全身性或微环境相关的信号发生变化,这可能有助于与衰老相关的昼夜转录组的重编程。另外有报道显示,卡路里限制在很大程度上阻止了与衰老相关的昼夜节律重编程,这一发现进一步支持了此观点,同时,卡路里限制也限制了SCN的节律。
 
  • 昼夜节律紊乱与成体干细胞衰老
在基因操纵的动物模型中,昼夜节律的破坏与衰老过程中部分组织和ASC区室的病理状况的发展有关。例如,PER2是衰老相关DNA损伤反应的负调控因子,特别是在偏向于淋巴的HSPC中;与野生型小鼠相比,Per2缺陷小鼠在DNA损伤反应中没有表现出造血干细胞分化缺陷,这可能有助于延长寿命。
 
全身Bmal1敲除和表皮特异性BMAL1缺乏导致分化的角质形成细胞数量的增加和类似衰老的表型。全身Bmal1 敲除小鼠的EpSCs表达更高水平的分化标记,在仅表皮表达BMAL1的小鼠中,这些分化标记部分恢复到野生型表达模式。因此,表皮固有的和非表皮的BMAL1都能阻止EPSCs的分化增加。有趣的是,与全身Bmal1 敲除小鼠相比,在完全黑暗中保持1周,仅表皮表达BMAL1的小鼠失去了表皮昼夜节律转录周期,但分化标志物在很大程度上保持表达减少。因此,BMAL1可能阻止EPSC分化,至少部分独立于其在生物钟中的功能。值得注意的是,Bmal1 敲除小鼠的表皮在受伤后伤口愈合的能力也降低。此外,去除毛囊中的BMAL1会导致老年小鼠中标签保留突起干细胞水平的增加和增殖细胞数量的减少,而Per1/Per2缺陷具有相反的表型。这表明生物钟决定了EpSC在整个衰老过程中的激活和维持。
 
中年Bmal1 敲除小鼠的卫星细胞数量减少,但在成年诱导肌肉特异性BMAL1缺失的小鼠中没有减少,这表明骨骼肌外源性BMAL1是调节卫星细胞水平所必需的,和/或BMAL1对卫星细胞维持的调节是在早期发育阶段确定的。与此相一致,Bmal1 敲除小鼠损伤后通过卫星细胞扩增的再生受到了损害。有趣的是,REV-ERBα(一种Bmal1基因转录抑制剂)对肌肉生成的影响与BMAL1相反,它通过抑制增殖和分化来抑制成肌细胞的肌生成;此外,Rev-ERBα的丢失通过增加损伤后增殖的卫星细胞扩张来促进肌肉再生。REV-ERBα还调节WNT信号和其他参与SC增殖的途径。BMAL1和REV-ERBα缺乏对卫星细胞数量的相反作用表明它们是通过它们在生物钟中相反的功能来调节卫星细胞的维持。
 
研究发现,几个核心节律基因与神经形成有关。Bmal1敲除小鼠在5-6周龄时神经形成增加,8周龄NSPC增殖没有变化,10-15周龄DG中NSPC增殖减少,这表明BMAL1是防止成年小鼠在年轻时和SC耗竭后NSPC过度增殖所必需的。值得注意的是,脑特异性Bmal1耗竭会引起神经病理学变化,小干扰RNA(siRNA)介导的体外神经球培养中Bmal1敲低会改变神经分化,表明BMAL1调节NSPCs或局部环境中的神经发生。此外,BMAL1促进NSPCs的迁移行为,并防止NSPC中ROS水平的增加。与Bmal1 敲除小鼠相似,Per2 敲除小鼠表现出神经形成增加,并且增殖型1型神经前体细胞数量增加;然而,只有Bmal1 敲除小鼠包含更多的增殖型2b型神经前体细胞、有丝分裂后3型神经前体细胞和SGZ中的新神经元。因此,PER2和BMAL1阻止了大量原本静息的NSPCs进入细胞周期,但只有Bmal1缺乏才会进一步促进更多的NSPC退出细胞周期,并在SGZ产生新的神经元。研究发现,在Rev-erbα 敲除小鼠中增殖性NSPCs的数量也有所增加,而Cry1/Cry2双敲除小鼠DG和SVZ衍生的神经球数量的减少。尽管Bmal1 敲除、Per2 敲除和Rev-erbα 敲除小鼠在神经发生中缺乏昼夜节律性,但很难将这些缺陷归因于节律中耗尽的基因的功能。由于NSPCs中是否存在振荡的生物钟仍然存在争议,因此不能排除一些观察到的与节律无关或依赖于微环境线索的表型。此外,Bmal1Rev-erbα缺乏会导致NSPC增殖增加,而Rev-Erba是BMAL1表达的负调节因子。因此,可以想象,不同的时钟相关基因可能会以一种独立于它们在生物钟中的作用方式影响神经形成,并通过不同的机制手段,即使NSPC增殖增加结果是相同的。
 
综上所述,核心节律基因在几种组织中的ASC池的衰老过程中起着重要的维持作用。一般来说,虽然BMAL1似乎通过减少年轻时的增殖来防止SC耗竭(HFSCs除外),但BMAL1在生物钟中的负调控经常(但不总是)具有相反的功能。因此,可能昼夜节律核心时钟的基因不仅通过节律相关的机制,而且通过非节律相关的功能来调节ASC的生理机能。生物钟基因调控的中断对ASC的生理影响具有组织特异性,这些效应可归结为细胞周期(Mis)调节、与分化和增殖相关的SC信号通路的调节以及细胞损伤的增加,这些机制如何在ASCs的整个衰老过程中起作用还需要进一步的研究。
 
  • 调节昼夜节律的衰老相关信号通路
参与调节衰老过程的三条信号通路:哺乳动物雷帕霉素靶标(mTOR)信号、sirtuin依赖的信号和单磷酸腺苷活化的蛋白激酶(AMPK)信号,被认为与调节时钟功能有关。
 
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD +)依赖的脱酰基酶SIRT1通过使PER2和BMAL1脱乙酰化而在核心节律水平上调节生物钟功能,并通过在CCGs的启动子处使组蛋白H3脱乙酰化而在输出水平上调节时钟功能。SCN中BMAL1和PER2表达的随年龄降低(导致SCN的昼夜节律功能下降)是依赖于SIRT1。Bmal1反过来调节限速酶烟酰胺磷酸核糖转移酶(NAMPT)在NAD+补救途径中的表达,导致SIRT1活性的昼夜调节。重要的是,SIRT1活性及其辅因子NAD+水平随着年龄的增长而降低,两者都与ASCs的衰老过程有关。
 
mTOR信号通过影响营养感知、蛋白稳态的维持、自噬、线粒体功能障碍、细胞衰老和ASC功能来调节衰老过程。mTOR调节SCN中细胞间耦合因子VIP的翻译,影响SCN进入转换的光/暗周期的能力。此外,mTOR信号组件核糖体蛋白S6激酶β1(S6K1)磷酸化BMAL1,导致BMAL1与翻译机制的节律性关联。mTOR信号还控制BMAL1蛋白稳定和外周组织中生物节律的周期长度。有趣的是,Bmal1缺乏增加了mTOR信号,而抑制mTOR信号延长了短暂Bmal1缺陷小鼠的寿命,论证了mTOR相关信号和BMAL1之间的双向关系。
 
AMPK作为细胞低能状态的传感器,可以激活几个与衰老相关的通路,包括mTOR和sirtuin通路。AMPK可以直接促进CRY的降解,并且通过酪蛋白激酶Iε(CKIε)激活PER降解,直接影响生物钟的调节。
 
此外,衰老相关的代谢改变可能影响SCs的节律功能。例如,多胺调节节律成分之间的相互作用。多胺水平随着年龄的增长而下降,导致持续黑暗中的昼夜节律期延长。此外,鉴于HIF1a在介导氧依赖节律复位和调节昼夜转录中的作用,HIF1a在老年组织中的积累可能会影响生物节律的功能。
 
 

未来展望

对昼夜节律的研究进展阐明了昼夜节律对SC功能的重要性,并表明昼夜节律对ASC生理的时间组织对于维持组织和SC的动态平衡是至关重要的。转录/翻译振荡器系统和昼夜节律输出似乎适应年轻生物体中每个ASC区室的特定稳态需求;相反,在老年ASCs中,昼夜节律功能转向应激主导的程序。
 
似乎并不是所有的ASC都建立了核心节律机制的转录振荡,即使生物节律成分在大多数SCs中都有表达。具体地说,胚胎干细胞和一些ASC亚室,包括IESCs、HSCs,可能还有一些NSPC群体,不会建立核心发条的强大转录振荡,而只在它们的分化过程中产生昼夜节律转录振荡。造成这种差异的机制背景和生理原因目前仍不清楚。胚胎干细胞(Embryonic stem cell,ESCs)和胎儿心脏中节律蛋白表达的转录后抑制与这些未分化细胞中缺乏生物节律功能有关,这种抑制的释放可能与分化过程有关。有趣的是,在体外β细胞分化过程中诱导多能干细胞的生物节律振荡也会触发表观遗传学变化,从而促进工程化胰岛的成熟,这表明在干细胞中建立功能节律可能是分化和成熟过程中的重要一步。亟需更多研究来揭示在不同的ASC间隔中是否有功能节律的生理意义,并确定哪些胞内或胞外信号决定节律功能和昼夜节律输出。
 
然而,重要的是,即使在缺乏振荡节律的SC群体中也观察到每日的生理节律,这表明在这些细胞中,昼夜节律是由微环境、非转录信号建立的。研究者们在表皮中发现了一个与生物节律无关的节律性的例子,每天的光周期足以维持参与翻译和氧化磷酸化调控的基因的每日转录振荡。ASC的生理和衰老是否受到昼夜节律独立于生物节律调节的影响仍有待确定。
 
在外周组织中,生物节律似乎起到了振荡器的作用,允许上游同步的环境信号-外部的(如光或食物摄取)和内在的(如代谢、温度或机械线索)结合在一起,从而协调下游的组织生理。在健康的年轻生物体中,同步信号的上游信号传递不受干扰会导致强劲的时钟摆动。衰老过程中信号转导的恶化,例如,通过减少自主神经支配、改变体液信号,以及增加ECM硬度,可能导致外周组织和ASCs中节律振荡器的稳健性降低。这反过来可能会降低节律对环境条件下变化的反应能力,并可能导致不同外周组织和成体干细胞之间有害的时钟不同步。这里还需要进一步的工作来澄清这些与衰老相关的干扰的影响。
昼夜节律输出对于ASC的动态平衡和正常的日常组织功能至关重要。至关重要的是,尽管幼鼠的生物节律输出主要涉及特定组织或成体干细胞区的稳态功能,但在老年鼠中,新的一组基因变得有节奏,通常涉及组织特异性的应激相关反应。尽管遗传因素以及应激和/或衰老诱导的转录和转录后调节因子是改变时钟输出的很好的候选者,但这种与年龄相关的昼夜节律重编程是如何调节的仍然是未知的。
 
最后,从研究发现可看出,昼夜节律性大多是通过单基因报告系统或转录水平来衡量的。考虑到生物节律复杂的转录后调节,在蛋白质水平和蛋白质修饰水平上评估核心时钟的状态,以及代谢组和微生物组的昼夜节律性的测量,这对于进一步加深我们对生物节律在衰老过程中如何影响组织和成体干细胞功能的理解将是非常重要的。
 

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