黄酮类化合物调控肿瘤细胞自噬的研究进展

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自噬(autophagy)是一种保守的细胞自我降解方式,是将受损细胞器或大分子物质由自噬泡包绕再通过自噬溶酶体降解再利用的过程。一般由细胞内外环境改变导致的饥饿状态所诱导,有时也能被不同于饥饿的应激信号所触发。无论自噬由哪种因素引发,其生物学特征保持高度的一致性,如自噬过程必由ULK1复合体(unc-51-likeautophagy activating kinase 1 complex)的激活而启动,继而引发自噬相关基因(autophagy related genesAtg)高表达等一系列级联反应[1]。自噬的过程是高度保守的,当自噬与疾病相关联时会产生多样化的结果,而且自噬又与细胞凋亡及细胞周期的调控密切相关,因此,自噬调控疾病发生发展的机制错综复杂,具有很高的研究价值与极大的研究潜力[2]

黄酮类化合物原指母核结构为2-苯基色原酮(2-phenyl-chromone)的多酚类化合物,现在泛指所有具有通过中央3碳链相互连接的色酮环和苯环结构的化合物。根据黄酮类化合物色酮环和苯环中间的C-3链的氧化程度、C-3链是否成环等结构特征,可将黄酮类化合物分为以木犀草素(luteolin)和黄芩苷(baicalin)为代表的黄酮、以水飞蓟素(silymarin)和橙皮苷(aurantiamarin)为代表的二氢黄酮、以槲皮素(quercetin)为代表的黄酮醇等。近年来出现了大量关于黄酮类化合物的抗肿瘤作用的研究报道[3]。很多研究中出现了与实验结果相关的肿瘤细胞自噬现象,而自噬的性质与作用受黄酮类化合物和细胞系的种类等因素影响而各异。本文就黄酮类化合物调控肿瘤细胞自噬进行综述,以期为中药调控细胞自噬的相关研究提供参考。

1  黄酮类化合物诱导肿瘤细胞发生自噬相关死亡

部分黄酮类化合物如槲皮素、黄芩苷、黄芩素(baicalein)、染料木素(genistein),作用于特定的肿瘤细胞可以诱导自噬相关死亡,该过程与典型细胞凋亡无关。在作用过程中可以检测到自噬的发生,且抑制自噬后可以逆转对肿瘤细胞的杀伤作用。

槲皮素对结肠癌Caco-2细胞具有抑制作用,该抑制作用与下调癌基因Ras的表达有关。另外,槲皮素的细胞毒作用不被半胱氨酸蛋白酶(caspase)抑制剂Z-VAD-FMK所干扰,而自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine3-MA)可以抑制此过程,显微镜下也观测到Caco-2细胞中自噬泡的聚集,这说明槲皮素是通过自噬而非凋亡途径杀伤Caco-2细胞[4]

槲皮素衍生物8-C-(E-phenylethenyl) quercetin8-CEPQ)可将结肠癌SW620HCT-116细胞阻滞于G2/M期,并引发非caspase依赖性死亡。另外,自噬相关基因表达上调表明自噬发生。而细胞外调节蛋白激酶(ERK)阻滞剂U0126可以显著抑制自噬进程以维持细胞活性。实验证实8-CEPQ可通过ERK途径诱导SW620HCT-116细胞发生抑制性自噬[5]

Lin[6]研究发现黄芩苷可通过非caspase依赖方式抑制膀胱癌T24细胞增殖,黄芩苷可上调T24细胞中自噬相关基因Atg5Atg7Atg12Beclin1Atg6)的表达和LC3B-II/LC3B-Ilight chainLC)的值,下调蛋白激酶BAKT)的表达,诱导自噬。而3-甲基腺嘌呤(3-MA)可成功逆转黄芩苷的自噬杀伤作用。

黄芩素抑制前列腺癌PC-3细胞和乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖与caspase激活无关。细胞中自噬相关基因Beclin1VPS34class III phosphatidylinositol-3-kinasePI3KC3)、ULK1Atg1)、Atg5Atg7及腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)的表达及LC3-II/LC3-I的值均可被黄芩素上调,这说明黄芩素可以通过AMPK/ULK1/ mTOR/Raptor途径增强自噬杀伤细胞。另外,自噬抑制剂LY294002可以逆转此过程,验证了自噬的杀伤作用[7]

染料木素作用于乳腺癌MCF-7细胞时,凋亡抑制基因survivin的表达和Bax/Bcl-2的值被显著下调,而caspase无显著变化。这说明染料木素可以激活非caspase依赖的细胞凋亡,且抗氧化酶CuZnSODMnSODTrxR被显著下调,谷胱甘肽过氧化物酶GSH-Px)被显著上调。而TrxR过表达及GSH-Px低表达与乳腺癌进展显著相关,这进一步支持了染料木素对乳腺癌MCF-7细胞的抑制作用[8]

芹菜素(apigenin)作用于人乳头状甲状腺癌BCPAP细胞,可以下调细胞分裂周期蛋白Cdc25C的表达,致使BCPAP细胞被阻滞于G2/M期,还可促进活性氧簇(reactive oxygen speciesROS)产生,引发自噬,3-MA可以逆转这一过程[9]

通过非凋亡途径或非典型凋亡途径诱导自噬抑制肿瘤细胞增殖的黄酮类化合物见表1

2  黄酮类化合物诱导自噬间接抑制肿瘤细胞

黄酮类化合物还可诱导肿瘤细胞发生自噬,继而对化疗药物产生增敏、诱导凋亡等作用(表2)。

Bi[10]研究发现,槲皮素可以诱导神经胶质瘤U87U251细胞发生自噬和凋亡。使用3-MA抑制自噬,U87U251细胞存活率明显升高。而自噬中后期时自噬抑制剂氯喹(CQ)可以增强槲皮素的杀伤力,且在此过程中LC3-II/LC3-I值是始终上调的。当再使用shRNA敲减Beclin-1基因,槲皮素联合CQ的杀伤作用被抑制。这说明槲皮素对于U87U251细胞的杀伤作用起源于自噬的启动和自噬泡的形成继而增强凋亡。在移植瘤模型中,CQ增强槲皮素的肿瘤抑制作用也被成功验证。槲皮素对神经胶质瘤MOGGCCM细胞具有较强的自噬诱导作用,索拉菲尼对MOGGCCM细胞具有较强的凋亡诱导作用,无自噬诱导作用,槲皮素与索拉菲尼相比,对热休克蛋白(heat shockproteinHSP) HSP27HSP72  的抑制作用更强。槲皮素和索拉菲尼联用可以下调HSP27HSP72的表达及RasRaf基因的表达,增强MOGGCCM细胞的自噬和凋亡[11]。另外,槲皮素诱导的自噬能够使胶质瘤干细胞/祖细胞(GSPCs)对放疗更加敏感[12]。槲皮素还能够强化肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TNF-relatedapoptosis- inducingligandTRAIL)介导的肺癌A549细胞的死亡,这与槲皮素所诱导的自噬有关。CQ可以消除槲皮素促进肿瘤细胞死亡的作用[13]Hyun[14]研究发现,槲皮素可以抑制HSP70的表达,诱导胰腺癌Panc-1MiaPaCa-2细胞发生自噬,槲皮素的自噬诱导作用远强于吉西他滨,而诱导凋亡作用弱于吉西他滨,将槲皮素与吉西他滨联用可以获得更好的肿瘤抑制效果。

黄芩苷作用于肝癌移植瘤裸鼠模型,可以使肿瘤相关巨噬细胞(TAM)复极到M1表型,M1表型的TAM对肝癌有抑制作用。这与黄芩苷通过诱导自噬降解肿瘤坏死因子受体相关因子2TRAF2)途径激活RelB/p52通路有关[15]

Zhang[16]研究发现,木犀草素作用于人骨肉瘤U20S细胞可以诱导产生ROS,继而引发自噬增强多柔比星对U20S细胞的凋亡诱导作用,效力强于单用多柔比星。

Pons[17]研究发现,对于雌激素受体(estrogen receptorERα/ERβ值高的乳腺癌MCF-7细胞,染料木素可降低细胞毒药物治疗的效果。而对于ERα/ERβ值低的乳腺癌T47D细胞,染料木素可以增强细胞毒药物的杀伤力,如染料木素能够显著提高他莫昔芬的T47D细胞的致死性自噬。另外,乳腺癌大鼠ig染料木素可以增强他莫昔芬的治疗敏感性,减少耐药,这可能与染料木素诱导自噬减少肿瘤未折叠蛋白应答有关[18]。染料木素还可以通过自噬和凋亡途径增强5-氟脲嘧啶(5-FU)对胰腺癌MIA PaCa-2细胞的杀伤力。这一作用在体内模型中也得到了验证[19]

Zheng[20-21]发现水飞蓟素对于ERα阳性的MCF-7细胞具有诱导自噬和凋亡的作用,而对于ERα阴性的MDA-MB-231细胞则只会诱导凋亡。在MCF-7细胞中水飞蓟素可以下调ERα的表达,继而下调ERK和雷帕霉素靶蛋白(mTOR)的表达,引发细胞自噬。在水飞蓟素作用的同时,细胞会产生保护性的ROS/RNSreactive nitrogen species),自噬可以清除ROS/RNS,当使用3-MA抑制自噬后,ROS/RNS水平上升,凋亡率也随之下降,说明在此过程中自噬是决定细胞杀伤作用的关键点。水飞蓟素和三氧化二砷联用可以通过诱导细胞周期阻滞、自噬、凋亡和坏死多种途径显著抑制前列腺癌DU14522Rv1细胞增殖[22]。水飞蓟素还可以诱导成纤维肉瘤HT1080细胞氧化应激,释放ROS,进而影响p38-NF-κB通路;另外,还能激活c-Jun氨基末端激酶(JNK)通路,上调Beclin1、抑癌基因p53的表达和LC3-II/LC3-I值,也可上调caspase-3的表达。这说明水飞蓟素抑制HT1080细胞增殖与自噬和凋亡相关。当使用3-MA抑制自噬后,凋亡也被抑制,细胞活力增强。说明在这个过程中,凋亡是自噬依赖性的[23-25]

3  黄酮类化合物抑制保护性自噬

黄酮类化合物有时也会抑制保护性自噬,增强联合用药的效果(表3)。

Li[26]研究发现环氧化物水解酶抑制剂t- AUCB对胶质母细胞瘤的细胞毒作用会由于HSP27Atg7的上调而被减弱,这与细胞自身的保护性自噬相关,而槲皮素可以抑制HSP27Atg7的表达,抑制自噬,t-AUCB在联合槲皮素后细胞毒作用显著增强。

恶性神经母细胞瘤SK-N-BE2IMR-32细胞可以通过自噬抵抗细胞毒药物的杀伤作用,而染料木素对这2个细胞系具有抑制自噬和诱导凋亡的作用,联合LC3 shRNA可以进一步增强对自噬的抑制,强化染料木素的细胞毒作用[27]TRAIL诱导肺癌A549细胞凋亡会受到保护性自噬的干扰,加入染料木素或者CQ后,自噬被抑制,细胞凋亡作用增强[28]20 μmol/L木犀草素和100 μmol/L水飞蓟素共同作用于胶质母细胞瘤U87MGT98G细胞,可以上调miR-7-1-3p的表达,抑制mTOR介导的自噬,最大程度地增强凋亡。且两药联合方案对胶质母细胞瘤的抑制作用在裸鼠移植瘤模型上也得到了验证[29]

4  黄酮类化合物诱导保护性自噬

在一些情况下,黄酮类化合物在抑制肿瘤细胞的过程中也会引发肿瘤细胞的反应性的保护性自噬,抑制该自噬可以增强药物对肿瘤细胞的杀伤力(表4)。

川陈皮素作用于胃癌SNU-16细胞,可以诱导内质网应激进而导致自噬和凋亡的发生。当使用CQ抑制自噬后,凋亡率显著上升。说明此过程中自噬起到保护SNU-16细胞的作用,抑制自噬可以增强川陈皮素的细胞杀伤作用[30]

槲皮素可以使急性髓系白血病HL-60细胞阻滞于G0/G1期,并引发自噬和凋亡的发生。使用3-MA抑制自噬后,细胞周期阻滞和凋亡被增强。而使用泛半胱天冬酶抑制剂(Z-VAD-FMK)抑制凋亡后,细胞杀伤作用被显著削弱[31]。槲皮素还能诱导胃癌AGSMKN28细胞发生细胞周期阻滞、自噬和凋亡。转染miR-143可以抑制Atg8从而阻断自噬的发生,自噬被阻断后,细胞存活率显著降低[32]Granato[33]研究发现,槲皮素可以抑制原发性渗出性淋巴瘤PEL细胞白细胞介素-6IL-6)和IL-10的释放,还可以抑制信号传导与转录激活因子3STAT3)、PI3K/AKT/mTOR通路、Wnt/β-catenin通路,通过这些途径抑制PEL细胞增殖,且对正常B细胞没有杀伤作用。在此过程中也检测到了自噬流,采用Baf-A1抑制自噬或者敲除BECN1基因后,细胞活力显著下降。当槲皮素作用于胶质母细胞瘤U373MG细胞,细胞周期被阻滞于G1期;槲皮素还可以诱导细胞凋亡,另外也可以上调p53JNK表达诱导自噬,使用CQ抑制自噬后,凋亡被增强[34]。槲皮素作用于卵巢癌CaOV3细胞,可以引发内质网应激继而通过STAT3/Bcl-2轴诱导凋亡。但是在引发内质网应激的同时也触发了保护性自噬,上调了Beclin1Atg5的表达和LC3-II/LC3-I的值,使用3-MA抑制自噬后,CaOV3细胞凋亡显著增强[35]。还有其他国内的研究者发现,槲皮素可以诱导宫颈癌HeLa细胞、乳腺癌MCF-7细胞、肝癌SMMC-7721细胞发生凋亡和保护性自噬,使用3-MACQ抑制自噬后,槲皮素的杀伤作用被增强[36-39]

黄芩素可以抑制肝癌HepG2SMMC-7721Bel-7402细胞的活性,在HepG2细胞中观察到AKT/mTOR通路的抑制和自噬的发生,使用CQ抑制自噬后,黄芩素的杀伤作用被增强[39]。在SMMC-7721Bel-7402细胞中,黄芩素通过内质网应激诱导细胞自噬和凋亡,使用siRNA干扰自噬后,凋亡被增强[40-41]Wang[42]研究发现,黄芩素可以诱导卵巢癌HEYA2780细胞自噬和凋亡,联用CQ可以上调DNA修复酶PARPpoly ADP-ribose polymerase)的表达,增强凋亡。

木犀草素对人皮肤鳞状细胞癌MET4细胞有诱导凋亡作用,但是敏感性会下降,这与丝氨酸/苏氨酸激酶(AKT)介导的自噬诱导有关,使用CQ抑制自噬可以增强木犀草素诱导的细胞凋亡[43]。芹菜素作用于乳腺癌T47DMDA-MB-231细胞,可以上调caspase-3PARP表达和Bax/Bcl-2值,诱导细胞凋亡,同时也伴随自噬。使用3-MA可以抑制自噬,增强凋亡[44-45]。芹菜素可以将结肠癌HCT116细胞阻滞于G2/M期,上调p53p21表达,同时也伴随自噬的发生。使用3-MA抑制自噬后,PARP表达上调,凋亡被增强[46]。芹菜素还可以诱导恶性神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞产生自噬和凋亡,加用N-(4-羟基苯基) 维甲酰胺(4-HPR)后,自噬被抑制,凋亡被增强,提升了总体杀伤力[47]。由于芹菜素能够显著抑制TF1细胞中mTORP70S6K的表达从而诱导保护性自噬,芹菜素可以降低长春新碱对人红系白血病TF1细胞的杀伤作用,提高TF1细胞对长春新碱的耐受力[48]

水飞蓟素作用于黑色素瘤A375-S2细胞可以抑制p53的表达,激活NF-κB,也能诱导自噬的发生。3-MA抑制自噬,从而增强水飞蓟素的肿瘤细胞杀伤作用[49]。对于结肠癌SW480SW620细胞,使用巴弗洛霉素A1Baf-A1)抑制自噬可以增强水飞蓟素对肿瘤细胞的抑制作用,而使用半胱天冬酶– 8抑制剂(Z-IETD-FMK)或Z-VAD-FMK抑制凋亡则会产生保护细胞的作用[50]。在水飞蓟素作用于前列腺癌PC-3细胞的实验中,其可以同时诱导细胞自噬和凋亡,ROS抑制剂二联苯碘(DPI)可以减轻水飞蓟素诱导的细胞自噬,而3-MA可以抑制自噬,二者均能增强水飞蓟素诱导的细胞凋亡[51]。水飞蓟素还可以破坏人皮肤鳞癌A431细胞线粒体膜电势、释放ROS和一氧化氮(NO)自由基诱导细胞自噬和凋亡同时发生,但是使用自噬抑制剂3-MA后,增强了其对细胞周期的阻滞和细胞凋亡[52]

5  黄酮类化合物诱导机制不明的自噬

目前,很多研究者在黄酮类化合物抑制肿瘤细胞增殖的研究中都检测到了自噬的发生,而自噬的具体作用未探明(表5)。

Saiprasad[53]用橙皮苷干预氧化偶氮甲烷(AOM)诱导的小鼠结肠癌模型,发现橙皮苷在诱导结肠癌细胞周期阻滞和凋亡的基础上,也会因为抑制PI3K/Akt/mTOR通路而激活自噬。橙皮苷的抗肿瘤作用还与抑制糖原合成酶激酶-3GSK-3β)继而抑制癌基因β-cateninc-Mycc-Jun的表达,抑制Aurora-A激酶继而上调抑癌基因p53p21的表达相关。而在此过程中,自噬与癌基因表达的相互作用却未能阐明。

槲皮素可以剂量依赖性地抑制卵巢癌OVCAR3细胞增殖,同时诱导OVCAR3细胞发生自噬[54]。罗亚男等[55]研究发现,槲皮素可以抑制肝癌HepG2细胞增殖,通过影响胞内Ca2+浓度诱导自噬,但没有通过验证明确自噬作用。槲皮素作用于乳腺癌MCF7细胞,可以诱导内质网应激,下调蛋白酶体4E-BP1p70S6K的表达,抑制mTOR而增强自噬[56]

Luo[57]研究发现,槲皮素纳米粒子可以使宫颈癌CaskiHeLa细胞阻滞于G0/G1期,并通过JAK/STAT通路促进细胞凋亡及PI3K/AKT/mTOR途径诱导细胞自噬,但自噬与抑制作用的关系仍未探明。而槲皮素纳米粒子作用于胶质母细胞瘤U87细胞,则是通过细胞自噬和凋亡双途径杀伤细胞,槲皮素可以通过PI3K/AKT/mTOR途径促进细胞自噬,还能上调促凋亡基因Apaf1caspase-3PARP的表达,诱导细胞凋亡。槲皮素纳米粒子的抑瘤作用在体内实验中已也得到验证[58]Enayat[59]使用槲皮素衍生物CHNQ2-chloro-1,4-naphthoquinone)干预人结肠癌HCT-116HT-29细胞,诱导氧化应激,经MAPK途径引发自噬和凋亡。另外,以槲皮素作为对照,槲皮素对HCT-116细胞具有剂量依赖性的细胞毒作用,但对HT-29细胞无作用。

黄芩苷可以诱导肝癌SMMC-7721细胞发生自噬和凋亡,这与其下调自噬和凋亡双抑制因子CD147的表达有关[60]。木犀草素可以诱导胃癌MGC803细胞发生细胞周期阻滞、线粒体相关凋亡和自噬[61],还可以诱导非小细胞肺癌H460细胞凋亡和非Beclin1依赖性的不典型自噬[62]。山柰酚可以通过AMPK/mTORAKT/mTOR途径诱导肝癌SK-HEP-1细胞自噬,还可以下调细胞周期蛋白CDK1Cyclin B的表达,使细胞周期阻滞于G2/M[63]

Jiang[64]发现水飞蓟素可以抑制肺转移腺样囊性癌ACC-M细胞增殖,在此过程中ACC-M细胞发生自噬。另外,在肺转移癌裸鼠模型中,水飞蓟素可以显著抑制动物模型左右两肺转移灶的增长。Li[65]发现水飞蓟素作用于肾癌786-OACHN细胞,均可检测出自噬流,且水飞蓟素是通过AMPK/mTOR途径促进细胞自噬。在伤口愈合实验和跨膜侵袭实验中通过将水飞蓟素诱导自噬和使用AMPK抑制剂compound C抑制自噬进行对比,发现水飞蓟素诱导的自噬可以抑制786-OACHN细胞转移,但自噬与细胞杀伤作用的关系并不明确。

6  结语与展望

不同的黄酮类化合物作用于不同的细胞系会诱导作用各异的自噬,主要体现在抑制和保护2个方面,可以是诱导抑制性自噬较为直接地使肿瘤细胞发生非凋亡相关的死亡,也可以是诱导自噬后进一步引发细胞周期阻滞、凋亡等其他致死效应,或者是在自噬发生的同时癌基因、抑癌基因、细胞周期相关因子受到调控,进而影响细胞生存,该种方式的自噬抑制作用则是间接的;还可能引发保护性的自噬,这种自噬可能是药物直接诱发,也可能是细胞自身内环境平衡被破坏后的负反馈。而黄酮类化合物诱导保护性和抑制性自噬的差异可能与具体黄酮类化合物的种类、给药方式和剂量及所作用的细胞系种类及细胞系所处的状态相关。如木犀草素作用于皮肤鳞状细胞癌MET4细胞可以诱导保护性自噬,而作用于骨肉瘤U20S细胞则诱导抑制性自噬;槲皮素在30 μmol/L的剂量下作用于胶质母细胞瘤U251U87细胞会抑制保护性自噬,剂量增大至100 μmol/L则会增强抑制性自噬,在而在25200 μmol/L剂量下作用于胶质母细胞瘤U373MG细胞会增强保护性自噬[10,26,34]。总之,自噬在黄酮类化合物抑制肿瘤细胞的过程中具有重要作用,且受多种因素影响。

槲皮素、黄芩苷、染料木素、水飞蓟素等黄酮类化合物对多种肿瘤细胞具有不同程度的抑制作用,且大部分黄酮类化合物在正常剂量下对正常细胞毒性低,相对传统细胞毒药物更加安全,具有较强的临床应用潜力[3]。目前大量关于黄酮类化合物的药效研究得到广泛开展,黄酮类化合物备受科学界关注,具有很强的研究价值。

大部分黄酮类化合物水溶性差、渗透性差、口服的生物利用度低,这些缺点严重限制了其临床应用转化[66]。黄酮类化合物纳米粒子或其衍生物相对于原单体来说具有更强的作用效能和生物利用度,副作用更少,还可以增强耐受的肿瘤细胞对药物的敏感度,提高疗效。且纳米粒子透过各类保护性生物膜屏障的能力也较原单体更强[67-68]。但是结构形态的改变也有可能改变药物的作用性质,如槲皮素作用于胶质母细胞瘤U87细胞可以起到抑制保护性自噬的作用,而槲皮素纳米粒子却可以诱导U87细胞发生自噬和凋亡[49,58]

对于诱导自噬的相关研究而言,自噬的性质判定具有重要意义,可用于指导强化杀伤肿瘤细胞。例如,黄酮类化合物杀伤肿瘤细胞,而肿瘤细胞自身产生的保护性自噬弱化了杀伤作用,此时联用自噬阻滞剂则能增强杀伤效果。因此,准确地判定自噬的作用有利于指导完善自噬相关药物的药效研究及应用策略。

从实验方法和深度上来看,很多研究尚缺乏通过反证法干预自噬及凋亡等途径来证实其作用,而且自噬的检测靶点在很多研究中也仅仅只涵盖自噬泡扩张的相关分子。黄酮类化合物调控肿瘤细胞自噬在很多实验中只是被检测到或者仅了解到部分自噬诱导的上游通路,因此,黄酮类化合物导致迥异自噬性质的机制仍待揭示。另外,黄酮类化合物诱导自噬的动物实验并不多见,研究者在细胞实验成功的基础上可以开展相应的动物实验,进一步为新型抗肿瘤药物的开发奠定基础,促进临床转化。

 

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