Nature | 小鼠衰老细胞图谱-系统记录衰老分子特征

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文章构建了一个包括23个组织和器官数据的单细胞转录组图谱,通过比较发现了多种细胞类型和器官的细胞特异性变化,及不同器官的细胞组成随年龄的变化。
 
近日,the Tabula Muris Consortium在《Nature上发表了一篇名为“A single-cell transcriptomic atlas characterizes ageing tissues in the mouse”的文章。文中报道了随衰老变化的详细的分子和细胞类型特异性的细胞图谱。在研究中评估了不同年龄特征的细胞类型特异性表现,如衰老、基因组不稳定性和免疫系统变化,同时,对于不同器官的细胞类型的变化进行评价比较,最终构建了包含丰富的分子生物学信息的转录图谱,即小鼠衰老细胞图谱,它提供了关于衰老最重要的特征是如何体现在广泛的组织和细胞类型中的分子信息,进一步加深了对于衰老的相关过程变化的理解。

衰老导致生理完整性逐渐丧失,导致功能受损和死亡易感性增加。尽管近年来虽然取得了迅速的进展,但许多健康生理机能逐渐丧失相关的分子和细胞过程仍不清楚。为了更好地了解这些过程,本研究构建了一个包括23个组织和器官数据的单细胞转录组图谱。在实验中首先对来自6个年龄组的雄性和雌性C57BL/6JN小鼠进行了单细胞RNA测序(图1a)。实验中制备了小鼠膀胱、骨髓等器官的单细胞悬液。采用微流体滴法收集所有6个年龄组的数据,在微孔板中选择3个月、18个月和24个月的时间点的单细胞进行分选。液滴数据使用3′端计数对大量细胞进行分析,而FACS数据允许对更少量的细胞进行更高灵敏度的测量,并允许获取整个转录子长度的序列信息。对同一只老鼠的多个器官的分析使我们能够获得受年龄、环境和表观遗传影响控制的数据。以已发表的数据为基础来执行其他时间点的半自动化程控注释数据(图1b)。从中获得了之前未在群体中发现的许多细胞类型,并提供了大量的特征基因表达谱相关的新信息。然后采用bbknn批处理对齐算法来校正方法相关的批处理效果,批处理校正后,使用无偏见的、基于图象的聚类方法对所有细胞进行聚类分析(1c-d),并评估在同一簇中注释相似的细胞的共现情况。例如,标注为B细胞或内皮细胞的细胞,无论其来源组织或处理方法如何,都倾向于占据相同的簇(图1e-f)。

单细胞数据能够解决大量实验中观察到的由于群体中每个细胞的基因表达变化引起的基因表达变化,或每个细胞的基因表达保持不变而该类型的细胞数量发生变化,或者两者都有。在组织中进行全球分析基因表达变化,在许多情况下基因表达的变化是由于两种细胞的数量变化和每个细胞的基因表达水平的变化引起的。Cdkn2a及其蛋白产物p16的表达是衰老的重要标志,实验中以此为例研究了表达Cdkn2a的细胞片段是如何随年龄变化的。FACS和液滴法分析显示,高龄小鼠中表达Cdkn2a的细胞比例比年轻小鼠高出一倍以上(图2a-b),p16在其表达的细胞中表达水平增加了两倍(2c-d)。Cdkn2a在衰老和表达它的细胞碎片中呈现出较高的相关性。
 
每种组织类型的细胞组成往往随年龄而变化。通过实验发现,随着年龄的增长,膀胱细胞类型的组成出现了明显的变化(图2e),其膀胱组织间充质间室减少了三倍,尿路上皮间室增加了相似的数量。观察发现膀胱尿路上皮细胞比例随年龄增加与已知年龄相关尿路上皮改变一致。通过差异基因表达分析对组织随年龄的整体变化进行评估,发现基质相关基因下调,而上皮相关基因上调,这与观察的结果相一致。同时,内皮细胞数量下降表明,小鼠膀胱老化可能与较低的器官血管化有关,这与最近的发现以及观察到的血管相关基因Htra1Fos的下调相一致(图2f)。
 
年龄相关的肾脏也随着发生变化。系膜细胞和毛细血管内皮细胞都是肾小球的核心细胞,它们的相对含量随着年龄的增长而减少(图2g),同时EgfAtp1a1的表达在组织范围内减少表明肾小球滤过率受损。值得注意的是,在毛细血管内皮细胞和系膜细胞中,局部Atp1a1的表达均随年龄增长而增加,差异基因表达分析的结果证明了这一结论。组织中Umod的表达减少表明正常的肾脏功能受损(图2g-h)。
 
在脾脏,T细胞的比例随着年龄的增长而减少,而浆细胞的相对数量增加,同时B细胞和浆细胞标记基因上调和Cd3d的下调(2i)。同样,在乳腺中发现T细胞数量下降。年龄相关的T细胞数量减少与感染性疾病和癌症的风险增加有关,实验结果表明,这种减少也可能发生在脾脏和乳腺。此外,编码AP1转录因子的基因(JunbJundFos)随着年龄的增长而上调,这与观察到的乳腺正常衰老伴随着该基因家族表达的增加相一致。

肝脏的组织结构也随着年龄的增长而变化。通过实验发现与年龄相关的肝细胞相对数量减少,且白蛋白的表达也呈下降的趋势。之前的研究表明,促炎巨噬细胞促进细胞衰老,且肝脏中Il1b基因随着年龄的变化而呈现显著的改变。通过肝脏普弗细胞的原位RNA染色对Clec4f标记和组织成分分析的结果发现,Clec4f阳性细胞的数量不随着年龄的增长而变化。肝窦内皮细胞(LSECs)在免疫防御中发挥独特作用,是肝脏中甘露糖受体(MRC1)的主要载体。研究发现普弗细胞Mrc1的表达随年龄增加,而肝脏内皮细胞中Mrc1的总体表达随年龄减少。在衰老肝脏中LSECs的吞噬能力下降,表明在损伤后LSECs增殖,或骨髓来源的LSEC祖细胞被募集至肝脏。这表明随年龄变化的LSECs基因特征的改变与其在免疫反应中的功能密切相关。
 
基因组不稳定性是衰老最广泛的特征之一,全长转录数据可以分析体细胞突变随年龄的积累。本研究使用基因分析工具包鉴定所有FACS样本的单核苷酸多态性。在特定组织中每个年龄组至少75%细胞中表达的基因,观察发现分析的所有器官中与年龄相关的突变数量增加,其中舌和膀胱影响最大。通过ERCC验证了突变的数量超过了扩增和测序错误的预期(图3)。尽管由于各种原因,转录组会夸大表观突变率,很难从转录组中推断出全基因组的绝对突变率,但观察到的趋势对于估计突变频率和基因组的稳定性具有非常重要的价值。

衰老也会影响免疫系统。实验中分别使用单细胞成像和示踪剂对FACS数据中出现的B细胞和T细胞受体的序列进行了计算重建分析了整个机体B细胞和T细胞之间的克隆关系。分别组装了6050个细胞的B细胞受体和6000个细胞的T细胞受体(图4a-b)。通过进一步对B细胞和T细胞库克隆性的变化的分析计算发现,24个月大的小鼠的免疫系统不太可能对新的病原体做出反应。这也表明了文献报道的老年人较年轻人对新感染的易感性更高,接种疫苗的益处更低的观点。最后,研究小组计算了一个整体多样性评分,以确定哪种细胞类型更容易受年龄变化的影响从中发现起源于大脑和肾脏的免疫系统细胞的多样性发生显著变化(图4c)。在大脑骨髓小胶质细胞,大多数年轻(3月)小胶质细胞聚集成簇1和6,而衰老的(18个月和24个月)小胶质细胞聚集成簇10,12和14(图4d)。与簇1和6相比,簇10,12和14富含干扰素反应或监管的基因,这表明在衰老的大脑中,小胶质细胞的这个小的促炎亚群有扩张的趋势。此外,“年轻”和“年老”簇间差异表达基因的列表与之前报道的阿尔茨海默病特异性小胶质细胞特征相似,在两种差异基因表达表中,前200个差异表达基因中有55个在两种差异基因表达列表中共享(图4e)。关于肾巨噬细胞,实验中发现两个簇状细胞的组成随年龄发生显著变化。簇10主要由1月和3月大小鼠的细胞组成,而簇13主要由18月、21月、24月和30月大的小鼠的细胞组成(图4f)。基因的差异表达显示簇10富含M2巨噬细胞的基因标记,而簇13类似于M1促炎巨噬细胞的状态。

本研究提供了一套包含详细的分子和细胞类型特异性衰老框架的细胞图谱,该图谱能够提供了表型和生理学的深层特征,并为理解哺乳动物在其生命周期中发生的细胞生物学变化的许多方面提供了参考,并进一步促进了基因组研究的深入。
 
作者介绍
The Tabula Muris Consortium组建了一个名为Tabula Muris的开源数据库,它是模式生物Mus musculus的单细胞转录数据库,其中包含来自20个器官和组织的近100,000个细胞。这些数据为细胞生物学提供了新的资源,揭示了特征不明显的细胞群中的基因表达,并允许对组织间共享的细胞类型的基因表达进行直接和有控制的比较,例如来自不同解剖位置的免疫细胞,还能够比较两种不同的技术方法:基于微流控滴的3′端计数在相对低的覆盖率下提供每个器官数千个细胞的调查;基于FACS为基础的全长转录本分析提供更高的灵敏度和覆盖范围。

 

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