【热点追踪】细胞的花式死法之细胞自噬

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这几天2020年诺奖已经陆续揭晓,我们的胖师兄和无花果童鞋也是相当及时的为大家解析了生理学或医学奖及化学奖研究内容在今后的国自然申请中如何巧妙运用[【热点追踪】解析2020诺贝尔生理学或医学奖【热点追踪】如何用诺贝尔化学奖拯救你的国自然?]Linlin是相当敬佩他们两位的专业精神。今天Linlin也来和大家聊聊诺奖,不过聊得是2016年的诺贝尔生理学或医学奖研究内容——细胞自噬,它同时是我们的连载推文——《细胞的花式死法》中一种“自食性(self-eating)”细胞死亡方式。
2016“细胞自噬”诺奖得主——大隅良典
(图片来源于网络)
什么是细胞自噬?
细胞自噬(autophagy)又称Ⅱ型程序性细胞死亡(细胞凋亡被称为I型程序性细胞死亡),是外界环境影响下,细胞在自噬相关基因的调控下由膜包裹部分胞质和细胞内需要降解的细胞器、蛋白质等小分子物质与溶酶体融合形成自噬溶酶体,降解内容物,以维持细胞稳态和细胞器的更新。根据下图,可以清晰地了解到细胞自噬大致分为四个阶段:(1)自噬的诱导;(2)自噬成核过程;(3)自噬体的延伸;(4)自噬体与溶酶体融合,内容物降解与回收。
细胞自噬的核心机制(图片来源:autophagy)
自噬研究相关实验与指标
细胞自噬是在自噬相关基因的调控下进行的,且每个阶段都有相应的标志物,涉及的调控通路包括PI3K-AKT-mTOR信号通路、AMPK-TSC 1/2-mTOR信号通路。因此,对自噬状态的判断大多围绕着自噬相关基因展开,最简单也是最常用的方法是用WB检测自噬相关蛋白,如Atg5、Atg7、BeclinI、LC3、P62等的蛋白水平变化。其中,最常检测的是LC3和P62(LC3和P62表达负相关),若 LC3-II 表达上升,p62 表达下降,则说明自噬活化,反之,则自噬被抑制。自噬体的荧光标记也是较为常用的自噬研究方法,主要是通过分子生物学的方法在LC3上插入绿色荧光蛋白GFP ,从而在荧光显微镜下通过观察荧光标记的自噬体状态来判断自噬的状态。由于LC3-II主要存在于自噬体的延伸阶段,因此,LC3-II 的积累可能是由于上游形成的自噬体数量增多,也可能是下游的自噬体与溶酶体的融合受阻,因此,需要进一步判断自噬状态,在GEP单荧光标记的基础上发展的双荧光检测法,即在LC3上同时插入GFP和RFP/mCherry可以解决这一问题,当溶酶体与自噬体融合时,GFP被溶酶体降解,此时自噬溶酶体就只发出红色荧光(RFP/ mCherry),反之两者不能融合,则绿色荧光与红色荧光merge为黄色,双荧光标记法是目前判断自噬状态非常有效的方法。
自噬的研究手段相对于其他细胞死亡方式更为齐全,商品化的自噬抑制剂和诱导剂种类也相对更多Bafilomycin A1是较为常用的自噬抑制剂,而雷帕霉素则是较为常用的自噬诱导剂。
除了分子层面的检测外,还可以直接在透射电镜下观察不同阶段的自噬状态。
自噬体双荧光检测(图片来源:autophagy)
自噬临床相关性与研究思路
自2016年获得诺奖以来,细胞自噬的研究热度一直持续高涨,仅2019年就有430项中标项目,将自噬与各种疾病及生命活动联系起来,涉及肿瘤的发生发展,病毒感染与宿主免疫,脓毒症等非肿瘤性疾病发生发展机制。

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