NATURE:AMPK-SKP2-CARM1信号级联在自噬中的转录调控作用

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作者:王晓蔷 张佳慧 宁含含

自噬是细胞在外界营养变化时维持自我稳态和生存的消化过程。尽管自噬相关研究相对成熟,,但自噬的转录和表观遗传调控的分子基础还有大片空白。Sung Hee Baek团队于2017年在Nature上发表“AMPK–SKP2–CARM1 signaling cascade in transcriptional regulation of autophagy”。确定了CARM1分子(co-activator-associated arginine methyltransferase 1)在自噬过程中发挥重要作用。

作者将小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)进行葡萄糖饥饿法处理后发现,H3R17me2和CARM1水平明显上调。接着探究葡萄糖饥饿法后上调的CARM1H3R17me2与自噬(自噬活性与lipidated IL3-II水平正相关,与p62水平负相关)相关性,WB、免疫荧光和电镜结果均显示CARM1与自噬活性正相关。

进一步探究葡萄糖饥饿法调控CARM1表达机制。发现葡萄糖饥饿后的CARM1上调仅发生在细胞核内,且核内CARM1泛素化被抑制。之后发现SKP2(E3连接酶复合体组分)可与CARM1特异性结合,推测其介导了CARM1泛素化。


接下来,作者发现葡萄糖饥饿后的SKP2下调和CARM1上调,且当SKP2 knockdown和突变时可使核内CARM1泛素化减弱。以上结果说明核内SKP2介导核内CARM1泛素化,SKP2在葡萄糖饥饿后下调,使得CARM1与CUL1(E3连接酶组分)结合率下降,使得CARM1稳定性增加。

  由于AMPK可被营养缺失诱导自噬激活,但核内AMPK在自噬作用尚未被确认。因此作者接下来探讨AMPK在自噬转录调控中的作用。结果显示,核内AMPKα2和pAMPK水平在葡萄糖饥饿后明显上调,但并不与CARM1和SKP2直接结合。因此作者使用Ampka1Ampkα双敲除MEFsAmpk DKO MEFs,发现葡萄糖饥饿法后CARM1上调和SKP2下调。葡萄糖饥饿未降低Skp2 mRNA水平,重组WT的AMPKα2却可发生葡萄糖饥饿后Skp2 mRNA水平的下调,说明AMPKα2下调SKP2表达

已有研究表明AMPK可磷酸化FOXO3a(一种转录抑制因子),介导细胞感知营养变化的细胞通路1。荧光素酶活性实验结果提示,Skp2启动子内有高度保守的FOXO反应原件(FRE),葡萄糖饥饿法降低Skp2启动子的荧光素酶活性,但FRE突变时荧光素酶活性正常。以上结果提示,FOXO是SKP2的重要转录因子ChIP assays结果显示,葡萄糖饥饿使AMPKα2和磷酸化的FOXO3a均向SKP2启动子募集。在Foxo1/3/4 TKO MEFs导入重组的WT型FOXO3a、FOXO3a的DNA结合区突变和FOXO3a sextuple T179A/ S399A/ S413A/S555A/S588A/S626A突变,仅WT型FOXO3a可降低Skp2 mRNA水平。Ampk DKO MEFs 敲低SKP2后的细胞自噬增强,在Ampk DKO MEFs过表达CARM1可恢复自噬活性。以上结果说明,核内AMPKα2在葡萄糖饥饿后上调,通过使POXO3a磷酸化抑制Skp2表达,上调CARM1而增强细胞自噬。

为进一步探究CARM1调控自噬机制,使用RNA-seq检测CARM1的WT和KO MEFs。结果显示CARM1的WT MEFs中自噬和溶酶体相关基因明显富集,Transcription factor motif analysis显示TFEB(溶酶体形成和自噬的主要调控者)是CARM1的主要转录因子2

进一步探究TFEB和CARM1关系。IP结果显示,CARM1和TFEB在细胞核内结合。荧光素酶活性实验结果显示,过表达CARM1可增加TFEB荧光素酶活性。敲低TFEB将减少CARM1向靶基因启动子募集,减少H3R17me2水平。结果说明CAMR1是TFEB的重要共激活因子。


最后,作者分析WT小鼠的肝脏自噬活性以验证CARM1和H3R17me2是自噬重要调控分子。空腹小鼠肝脏内CARM1和LC3酯化水平高,鞣花酸(H3R17甲基化抑制剂)下调LC3酯化。

综上所述,CARM1在自噬过程中发挥重要作用。营养缺乏时的核内发生AMPK依赖性FOXO3a磷酸化,抑制SKP2转录,上调CARM1表达,增加H3R17me2水平,通过TFEB激活自噬相关和溶酶体基因表达。本研究提示鞣花酸有治疗自噬相关疾病前景。



Reference

1.       Eijkelenboom A, Burgering BM. Foxos: Signalling integrators for homeostasis maintenance. Nature reviews. Molecular cell biology. 2013;14:83-97

2.       Settembre C, Di Malta C, Polito VA, Garcia Arencibia M, Vetrini F, Erdin S, et al. Tfeb links autophagy to lysosomal biogenesis. Science (New York, N.Y.). 2011;332:1429-1433


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文章来源于 Epigenetic Regulation

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